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Resuma el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para copiar y amplificar cantidades mínimas de ADN.
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¿Qué es? El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de los ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico llamado "hold“, a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje.
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¿Para qué? Es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas jornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes.
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¿En qué consiste? Ver video
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Primer ciclo
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Segundo, tercer y cuarto ciclo
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Inicialización Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-98 °C que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
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Desnaturalización Se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
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Alineamiento (unión del primer)
A continuación el primer se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65 °C durante segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del primer es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el primer, y empieza a sintetizar ADN. Los primeres actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
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Extención/ elongación
Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del primer como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP's complementarios. La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos, generalmente superior a los 70ºC. El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.
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Conservación Conservación final
Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. Conservación final Este paso se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo
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