Secuenciación. Estrategia general Degradación específica y fraccionamiento de polinucleótidos de interés a fragmentos pequeños secuenciables. Degradación.

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1 Secuenciación

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3 Estrategia general Degradación específica y fraccionamiento de polinucleótidos de interés a fragmentos pequeños secuenciables. Degradación específica y fraccionamiento de polinucleótidos de interés a fragmentos pequeños secuenciables. Secuenciación de fragmentos individuales. Secuenciación de fragmentos individuales. Ordenamiento de los fragmentos por repetición de los pasos anteriores. Ordenamiento de los fragmentos por repetición de los pasos anteriores.

4 Secuenciación Tipo Sanger El método de secuenciación de Sanger aprovecha la forma normal de la replicación del DNA El método de secuenciación de Sanger aprovecha la forma normal de la replicación del DNA Para extender la cadena de DNA, usando la DNA polimerasa, deberá estar presente un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la deoxiribosa Para extender la cadena de DNA, usando la DNA polimerasa, deberá estar presente un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la deoxiribosa Los fragmentos se generan al agregar pequeñas cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la reacción lo que interrumpe la polimerización cada vez que son incorporados en la cadena de DNA Los fragmentos se generan al agregar pequeñas cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la reacción lo que interrumpe la polimerización cada vez que son incorporados en la cadena de DNA La polimerasa usada deberá de carecer de la actividad de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que funcione el método La polimerasa usada deberá de carecer de la actividad de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que funcione el método

5 H P O OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azucar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’4’Dideoxinucleótidos La secuenciación de DNA usando el método de Sanger emplea 2’3’- dideoxinucleótidos trifosfatados ademas de los normales 2’- deoxinucleótido trifosfatado La secuenciación de DNA usando el método de Sanger emplea 2’3’- dideoxinucleótidos trifosfatados ademas de los normales 2’- deoxinucleótido trifosfatado Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo, y la polimerización del DNA ocurre solo en la dirección 5’- 3’, cada vez que un 2’3’- dideoxinucleótido trifosfato es incorporado la extención se detiene. Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo, y la polimerización del DNA ocurre solo en la dirección 5’- 3’, cada vez que un 2’3’- dideoxinucleótido trifosfato es incorporado la extención se detiene. H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato 2’-deoxinucleótido monofosfato

6 ESQUELETO AZUCAR-FOSFATO H P O HO O O CH 2 HOH P O O HO O O CH 2 H P O OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N O O N NH N N N O NH 2 N B A S E S Los 2’3’ dideoxi- nucleótidos terminan la síntesis del DNA O H P O HO O O CH 2 HO O H2NH2N N HN N N H HOH P O O O CH 2 CH 3 O O HN N OH H P HO O O CH 2 H O N O H2NH2N N H2OH2O 2’3’dideoxinucleótido

7 Se utilizan 4 tubos con distintas mezclas de reacción, cada uno con un solo ddNTP.. Se producen una serie de moléculas de ADN de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucleótido, marcadas todas radiactivamente por el extremo 5'.

8 Sanger (Método de terminación de cadena) Se necesitan: ssDNA como molde. DNApol I del fago T4. Primer (20 nt) por lo general marcado. dATP, dCTP, dGTP y dTTP ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP

9 Dye-Terminator

10 Single Molecule Real Time Sequencing (SMRT) Single Molecule Real Time Sequencing (SMRT) Esta técnica utiliza la cámara nanofotónica ZMW (Zero-mode waveguide). Esta técnica utiliza la cámara nanofotónica ZMW (Zero-mode waveguide). Una DNApol se fija al fondo de ésta cámara junto con 1 sola molécula de ssDNA como molde. Una DNApol se fija al fondo de ésta cámara junto con 1 sola molécula de ssDNA como molde. Cada base posee un marcador fluorescente (fluoróforo) diferente en su fosfato terminal. Cada base posee un marcador fluorescente (fluoróforo) diferente en su fosfato terminal. Cuando se incorpora un nucleótido se libera el fosfato marcado el cual difunde fuera del área de registro de la cámara. Cuando se incorpora un nucleótido se libera el fosfato marcado el cual difunde fuera del área de registro de la cámara. La cámara permite observar la incorporación de un solo nucleótido por la DNApol. La cámara permite observar la incorporación de un solo nucleótido por la DNApol. Un detector registra la señal fluorescente y un software determina la base incorporada. Un detector registra la señal fluorescente y un software determina la base incorporada.

11 La secuenciación por hibridación es un método no enzimático que usa un chip de DNA. En este método, un único reservorio de DNA se marca mediante fluorescencia y se hibrida con un colección de secuencias conocidas. La secuenciación por hibridación es un método no enzimático que usa un chip de DNA. En este método, un único reservorio de DNA se marca mediante fluorescencia y se hibrida con un colección de secuencias conocidas. La espectrometría de masas también se puede usar para secuenciar las moléculas de DNA; las reacciones convencionales de terminación de la cadena producen moléculas de DNA de diferentes longitudes y la longitud de esos fragmentos se determina entonces por las diferencias de masa entre ellas (en lugar de utilizar una separación por gel). La espectrometría de masas también se puede usar para secuenciar las moléculas de DNA; las reacciones convencionales de terminación de la cadena producen moléculas de DNA de diferentes longitudes y la longitud de esos fragmentos se determina entonces por las diferencias de masa entre ellas (en lugar de utilizar una separación por gel). Otros métodos de secuenciación

12 Pyrosequencing Un primer se hibrida con ssDNA y se incuban con: DNApol DNApol ATP sulfurilasa ATP sulfurilasa Luciferasa Luciferasa Apirasa Apirasa Sustratos, APS y luciferina Sustratos, APS y luciferina La adición de nucleótidos es llevado a cabo de a uno a la vez.

13 Cada señal es proporcional al número de nucleótidos incorporados. En lugar de ATP se utiliza dATPα S (desoxiadenosina alfa-tio trifosfato) para que no interfiera con la reacción catalizada por la luciferasa. Cuando la degradación se completa, se agrega un dNTP diferente.

14 A medida que el proceso continua, se sintetiza la cadena complementaria y la secuencia de nucleótidos es determinada por los picos registrados en un pirograma.