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Reconocimiento e interacción molecular entre drogas y proteínas plasmáticas. Posibilidades de enantiodiferenciación S. Sagrado. 2009.

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1 Reconocimiento e interacción molecular entre drogas y proteínas plasmáticas. Posibilidades de enantiodiferenciación S. Sagrado. 2009

2 1.- Introducción INTRODUCCIÓN

3 PROYECTO DE CONTINUA VIGENCIA EN LA COMUNIDAD CIENTÍFICA EFECTOS TOXICOLÓGICOS EFECTOS TOXICOLÓGICOS 1.- Introducción EFECTOS TERAPÉUTICOS ESTUDIO DEL MODO EN QUE LAS DROGAS INTERACCIONAN CON LOS ORGANISMOS VIVOS Problema no resuelto…

4 Comercialización ~ 10 años 600 millones 1.- Introducción Bajo índice de éxito Fase preclínica Ej. Elevado coste Fase clínica (ensayos con humanos) Mejorar calidad (?) Filtro rápido disminuir moléculas:

5 Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica droga candidata Introducción Farmacocinético (la fracción unida no puede ser distribuida, metabolizada o excretada) Farmacodinámico (solo la fracción libre es activa). Farmacocinético (la fracción unida no puede ser distribuida, metabolizada o excretada) Farmacodinámico (solo la fracción libre es activa). Comercialización Ej. Procesos, interacciones, interrelaciones, etc.

6 Consideraciones éticas Costosos Laboriosos Consideraciones éticas Costosos Laboriosos Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica droga candidata Fase preclínica Introducción Ej. In vivo Tradicionalmente:

7 Reduzcan: el uso de animales de experimentación Tiempo, esfuerzo, costes Reduzcan: el uso de animales de experimentación Tiempo, esfuerzo, costes Evaluación farmacocinética, farmacodinámica y toxicológica droga candidata Fase preclínica Introducción Métodos alternativos (alto rendimiento) Métodos alternativos (alto rendimiento) Ej. Filtro rápido In vivo

8 1.- IntroducciónMétodos alternativos Organismos inferiores no protegidos Bacterias Hongos Protozoos Algas Plantas Animales invertebrados Vertebrados en las primeras etapas del desarrollo (embriones) Peces Anfibios Reptiles Aves Mamíferos Métodos in vitro (material biológico) Órganos Líneas celulares Métodos in silico (Modelos matemáticos, algoritmos optimización) Relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR) Docking molecular, interacciones selectivas Métodos in quimico (Técnicas separación/analíticas + modelos matemáticos) Relaciones cuantitativas retención-actividad (QRAR) Electroforesis capilar (CE), interacciones selectivas

9 1.- IntroducciónMétodos alternativos Organismos inferiores no protegidos Bacterias Hongos Protozoos Algas Plantas Animales invertebrados Vertebrados en las primeras etapas del desarrollo (embriones) Peces Anfibios Reptiles Aves Mamíferos Métodos in vitro (material biológico) Órganos Líneas celulares Métodos in silico (Modelos matemáticos, algoritmos optimización) Relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR) Docking molecular, interacciones selectivas Métodos in quimico (Técnicas separación/analíticas + modelos matemáticos) Relaciones cuantitativas retención-actividad (QRAR) Electroforesis capilar (CE), interacciones selectivas Estructura, comput. Moléculas, experimental Alejados del modelo animal filtro rápido Sinergias Alejados del modelo animal filtro rápido Sinergias

10 1.- IntroducciónDocking molecular INFORMACIÓN: + Estructura drogas + Estructura de las proteínas (Cristalografía RX, RMN) (Bases de datos) Conformación óptima (droga-proteína) Objetivo: Cuantificar el grado de reconocimiento molecular (vía minimización de la energía libre del sistema) … complejo estable Generalización de los estudios Enfoque teórico (in silico) Obtención de: - Constantes de afinidad (K i ) - Protein binding (PB %) Docking/Interacción droga- proteínas plasmáticas (optimización) LIMITACIONES (actuales): - Nivel de exactitud limitado (Validación, métodos in quimico) - Tiempo de computación elevado (se solucionará con el tiempo)

11 1.- IntroducciónEC EC/Interacción droga-proteínas plasmáticas (equilibrio) Equilibrar mezclas droga-proteína [D/P, Diseño experimental] Separar una fracción (ej. droga libre, d ) Cuantificar su concentración (d ) [Modelos de regresión] Enfoque experimental (in quimico) r : fracción de droga unida b : concentración de droga unida d : concentración de droga libre D : concentración total de droga P : concentración total de proteína m : clase de sitios de unión independientes n i : número de sitios de unión primarios/molécula proteína r : fracción de droga unida b : concentración de droga unida d : concentración de droga libre D : concentración total de droga P : concentración total de proteína m : clase de sitios de unión independientes n i : número de sitios de unión primarios/molécula proteína Obtención de las constantes de afinidad (K i ): Protein binding (PB %):

12 1.- IntroducciónEC EC/Interacción droga-proteínas plasmáticas (equilibrio) Equilibrar mezclas droga-proteína [D/P, Diseño experimental] Separar una fracción (ej. droga libre, d ) Cuantificar su concentración (d ) [Modelos de regresión] Enfoque experimental (in quimico) VENTAJAS: Equipamiento simple, bajo consumo reactivos, relativa rapidez y elevada eficacia Adecuada para separar enantiómeros Aproximar condiciones fisiológicas

13 INVERSIÓN Desarrollo de drogas enantioméricamente puras 1.- Introducción implicaciones evidentes sobre la farmacodinamia, farmacocinética y toxicidad de las drogas quirales La naturaleza quiral de los sistemas vivos: Interés por los enantiómeros:

14 2.- Objetivos OBJETIVOS

15 2.- Objetivos Evaluar la sinergia, entre sistemas: - in quimico instrumentales basados en modalidades electroforéticas - in silico de Docking molecular. Involucrar drogas quirales. Objetivo primordial: 2 niveles: 1.- Posibilidades de cribado (discriminación), 2.- calidad de las estimaciones (predicción)

16 2.- ObjetivosObjetivos concretos (1) Desarrollar/evaluar microsistemas electroforéticos para la evaluación de las interacciones selectivas/enantioselectivas droga-proteínas plasmáticas - Interacciones competitivas (o cooperativas) con compuestos endógenos y otras drogas

17 2.- ObjetivosObjetivos concretos (2) Obtener información y parámetros derivados de interacciones selectivas/enantioselectivas de drogas mediante Docking molecular. - Análisis a nivel molecular de las principales fuerzas responsables de las interacciones. Proyecto colaborativo, Dr. K. Bissety. Durban University of Technology (DUT, Sudáfrica) Proyecto bilateral (HS , Acciones integradas hispano-sudafricanas. MICIIN).

18 2.- ObjetivosObjetivos concretos (3) Crear de una base datos con los parámetros obtenidos mediante las estrategias experimental y computacional - Incluyendo descriptores moleculares, datos del análisis a nivel molecular y de otros métodos in vitro, in vivo, etc. - Estudios QSAR: - Establecer relaciones entre parámetros - Evaluar consistencia de los resultados - Evidenciar limitaciones y posibilidades de mejora

19 3.- Metodología METODOLOGÍA (Resultados)

20 3.- Metodología Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA Docking molecular

21 3.- Metodología Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA Docking molecular Inicialmente módulos del programa QUANTUM® (q-Albumin, Docking, q-ADME, q-TOX) Estimaciones computacionales Realiza un cálculo automático de las constantes de afinidad a los dos sitios principales del HSA sitio I, warfarina sitio II, diazepam Se realizarán simulaciones basadas en las estimaciones K 1 y K 2 para ver como se ajustan a estos modelos teóricos a las estimaciones experimentales (EC) P = cte D = cte

22 3.- Metodología Interacciones selectivas droga (enantiómero)-HSA Docking molecular Estimaciones computacionales Realiza la optimización de la interacción entre drogas y cualquier proteína de la que se disponga de la información estructural Puede emplearse para: - Explorar otras proteínas plasmáticas - Interacciones entre-moléculas - Información a nivel molecular Átomo de O (Diazepam) interactuando con el grupo OH del residuo Tyrosine 411 (zona polar dentro del bolsillo hidrofóbico del sitio 2 del HSA) Sitio 2 en el HSA Inicialmente módulos del programa QUANTUM® (q-Albumin, Docking, q-ADME, q-TOX)

23 3.- Metodología Interacciones selectivas droga/enantiómero-HSA CE

24 3.- Metodología Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA CE Modalidad electroforética: HSA Droga, enantiomero puro AGP Mezcla HSA - AGP Conjunto de proteínas plasmáticas (plasma/suero/ suero sintético) Ultrafiltración (membrana) + ZCE FA: Análisis frontal ZCE: Electroforesis capilar zonal ACE: Electroforesis capilar de afinidad Droga quiral (mezcla racémica de enantiómeros) Selector quiral: - Proteínas (HSA) - Ciclodextrinas (neutras, aniónicas y catiónicas) CE-FA d d Ultrafiltración (membrana) + ACE Ojo el selector altera el eq.

25 3.- Metodología Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA CE Ejemplo: (Resultados) FA: Análisis frontal ZCE: Electroforesis capilar zonal ACE: Electroforesis capilar de afinidad Droga quiral (mezcla racémica de enantiómeros) Selector quiral: - Proteínas (HSA) Ultrafiltración (membrana) + ACE Ojo el selector altera el eq. 4 Antihistamínicos quirales-HSA

26 3.- Metodología Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA CE I SITIO II Diazepam SITIO III: Digitoxina WarfarinaSITIO I Caracterización de la interacción de los enantiómeros: marcadores selectivos de los sitios de unión al HSA Desplazan a los enantiómeros (permitiendo reconocer el sitio de unión donde están unidos)

27 3.- Metodología Interacciones selectivas y enantioselectivas-HSA CE Modelo competitivo: los dos enantiómeros compiten por el mismo sitio (1 ecuación; [E 1 ] y [E 2 ]) Modelo independiente: los dos enantiómeros se enlazan a diferentes sitios (2 ecuaciones) (Antihistamínico) 1ª evidencia publicada de unión enantioselectiva de antihistamínicos quirales a HSA … Fenotiazinas quirales K E2 / K E1

28 Reconocimiento e interacción molecular entre drogas y proteínas plasmáticas. Posibilidades de enantiodiferenciación S. Sagrado. 2009


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