Polinucleótidos.

Presentación del tema: "Polinucleótidos."— Transcripción de la presentación:

1 Polinucleótidos

2 Extremo 5’ Enlace fosfodiéster Polinucleótido Extremo 3’

3 Formas de representación de polinucleótidos
5’- CpApTpTpGpCpGpGpApApTpGpCpCp -3’ 5’-CATTGCGGAATGCC-3’ 3’-GTAACGCCTTACGG-5’

4 3’ 5’ Polinucleótido en doble hélice 5’ 3’

5 Propiedades de los polinucleótidos, 1
1. Absorción de luz UV a 260 nm Hipocromismo % A260, 120 En el DNA doble hélice se da el fenómeno de hipocromismo: el DNA desnaturalizado por el calor absorbe un % más que el DNA nativo 110 100 T (ºC)

6 Propiedades de los polinucleótidos, 2
2. Reacción positiva de los polidesoxirribonucleótidos a la difenilamina y al reactivo de Schiff 3. Reacción positiva de los polirribonucleótidos al orcinol 4. Reacción con agentes intercalantes (acridinas) 5. Hidrólisis completa del RNA con álcali; el DNA es resistente a álcali.

7 Rotura química de polinucleótidos
- Tratando un polinucleótido (DNA) con dimetil sulfato (DMS) tiene lugar la metilación de purinas; por calentamiento a pH neutro se rompe el enlace glicosídico y queda un sitio apurínico; el tra- tamiento ulterior con ácido diluído rompe la cadena por el sitio apurínico. - Tratando un polinucleótido (DNA) con hidrazina se rompe el enlace glicosídico de las pirimidinas, quedando un sitio apirimi- dínico; el tratamiento ulterior con piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidínico.

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9 Calentamiento

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11 Rotura enzimática de polinucleótidos
Endonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster situados en el interior de una cadena polinucleotídica, y suelen ser específicas de cada ácido nucleico: - Ribonucleasas - Desoxirribonucleasas Exonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster situados en los extremos (3’ o 5’) de una cadena polinucleotídica, y suelen atacar indistintamente ambos tipos de ácidos nucleicos: - Exonucleasa de bazo (rotura tipo b) - Exonucleasa de veneno de serpiente (rotura tipo a)

12 Rotura tipo a: Da lugar a una mezcla de 5’-nucleótidos

13 Rotura tipo b: Da lugar a una mezcla de 3’-nucleótidos

14 Endonucleasas: DNAasa I: rotura completa, tipo a DNAasa II: rotura completa, tipo b RNAasa pancreática: rompe (b) enlaces Py-X RNAasa T-1: rompe (b) enlaces G-X Endonucleasas de restricción Exonucleasas: Exonucleasa de bazo: libera 3’-nucleótidos Exonucleasa de veneno de serpiente: libera 5’-nucleótidos

15 Endonucleasas de restricción, 1:
1. Reconocen secuencias específicas, por lo general palindrómicas: 5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’ 3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’ La secuencia reconocida en este caso es GAATTC

16 Endonucleasas de restricción, 2:
2. Suelen romper el polinucleótido dejando extremos cohesivos: 5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’ 3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’ AATTCCCAATAACCCTT -3’ GGGTTATTGGGAA -5’ 5’- ATCGTTGCCTACAATTG 3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAA Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por la misma endonucleasa de restricción

17 Endonucleasas de restricción, 3:
3. Al reconocer secuencias relativamente largas, cortan el DNA por un número muy limitado de sitios, lo que facilita la manipula- ción experimental del mismo. Algunas endonucleasas de restricción: EcoRI GAATTC ClaI ATCGAT HaeIII GGCC RsrII CGGATCCG

18 Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasa
de restricción EcoRI, que es 5’-GAATTC-3’ En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y 20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azar sería de 0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucleótidos

19 Separación electroforética
de fragmentos de restricción del DNA. Una vez separados, se tratan con bromuro de etidio (un agen- te intercalante) y se observan bajo luz UV.

20 Método de Sanger para secuenciación de polinucleótidos

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22 Síntesis en presencia de ddGTP

23 Síntesis en presencia de ddATP

24 Síntesis en presencia de ddCTP

25 Síntesis en presencia de ddTTP

26 A continuación, las cuatro mezclas
se someten a electroforesis en poli- acrilamida-SDS. Este método sepa- ra polinucleótidos en función de su tamaño, de forma que los más cortos se desplazan más rápidamente. Como el cebador está marcado radioactiva- mente, revelamos la plancha de electroforesis por autorradiografía. Con esto leemos directamente la secuencia complementaria del poli- nucleótido inicial: 5’-AAGGCACATTCGATGCAAT- CGAATCGAACGTCCCAAAAG- GATTCCGGGAAAATG-3’