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Trypanosoma cruzi Protozoo, hemoflagelado Hospedadores Intermediario: Triatoma infestans Subfamilia: Triatominae Taxonomía Familia: Reduvidae Orden: Hemíptera.

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Presentación del tema: "Trypanosoma cruzi Protozoo, hemoflagelado Hospedadores Intermediario: Triatoma infestans Subfamilia: Triatominae Taxonomía Familia: Reduvidae Orden: Hemíptera."— Transcripción de la presentación:

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2 Trypanosoma cruzi Protozoo, hemoflagelado Hospedadores Intermediario: Triatoma infestans Subfamilia: Triatominae Taxonomía Familia: Reduvidae Orden: Hemíptera Definitivo: Hombre y animales domésticos y selváticos Prevalencias América Latina : Vías de transmisión 100 millones en riesgo vectorial 16 a 18 millones infectados transfusional Argentina: vertical infectados tx. órganos accidental

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4 CARGA SOCIAL América Latina: 16 a 18 millones de infectados Cono Sur: 6.5 millones de infectados Mortalidad por año: (Banco Mundial) (OMS) AÑOS DE VIDA PERDIDOS POR INCAPACIDAD (AVADS) MAYOR CARGA DE ENFERMEDAD Respiratorias Agudas Diarreas Sida Enfermedad de Chagas

5 OBJETIVO DEL PROGRAMA TRATAMIENTO QUÍMICO CON INSECTICIDAS (MONODOSIS DE PIRETROIDES SINTÉTICOS CON ACCIÓN RESIDUAL) A TODAS LAS VIVIENDAS DE AREA ENDÉMICA. INSTALACIÓN DE LA VIGILANCIA CON PARTICIPACIÓN COMUNITARIA MEDIANTE MÚLTIPLES EFECTORES. DETECCIÓN DE INFECCIÓN CHAGÁSICA A TODOS LOS NIÑOS MENORES DE 15 AÑOS RESIDENTES EN AREAS DE VIGILANCIA. ATENCIÓN MÉDICA Y TRATAMIENTO SUPERVISADO DE LOS INFECTADOS CHAGÁSICOS. CONTROL DE LA MADRE CHAGÁSICA Y SU HIJO HASTA EL AÑO DE VIDA. CONTROL DE BANCOS DE SANGRE Y DE LOS LABORATORIOS (CONTROL DE CALIDAD EXTERNO). CONTROL DE DADORES Y RECEPTORES DE TRANSPLANTES DE ÓRGANOS.

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12 PREVALENCIA DE INFECCIÓN POR TRIPANOSOMA CRUZI EN BANCOS DE SANGRE PÚBLICOS Y PRIVADOS ARGENTINA AÑOSN° de Muestras que Controlan N° de Muestras Reactivas Prevalencia % * *Falta Incorporar datos de Santa Cruz Fuente: Centro Nacional Red de Laboratorios ANLIS - Malbrán

13 Modalidad evolutiva de la Enfermedad de Chagas con respecto al umbral clínico %

14 Evolución serológica y parasitológica en pacientes infectados por T. cruzi

15 Diagnóstico de la infección por Trypanosoma cruzi Medidas de control de la endemia Control y tratamiento de la enfermedad de Chagas (1) Transmisión vectorial vigilancia entomológica Detección de la madre Chagásica y seguimiento del recién nacido Seguimiento serológico de los niños Control obligado de la sangre donada para transfusiones

16 Dupla Serológica

17 Métodos serológicos Métodos parasitológicos Normas de Diagnóstico para la infección de Chagas Chagas agudo X X Transmisión materno - infantil Antes de 6 meses X Chagas asintomático crónico X Control de los donantes de sangre y de la sangre a transfundir X Detección de la Infección en pacientes inmunosuprimidos Dador X Receptor X X HIV X Después de 6 meses X X X

18 CHAGAS-HIV Manifestaciones más graves y frecuentes en esta coinfección: 1-Compromiso SNC 2-Afecciones cardíacas Alta Morbimortalidad por reactivación de la infección chagásica favorecida por las diversas vías probables de contagio relacionadas con la urbanización de la enfermedad debido a la migración desde zonas endémicas hacia las grandes ciudades en busca de mejores condiciones de vida El seguimiento de estos pacientes debe hacerse con protocolo de monitoreo preestablecido utilizando métodos altamente sensibles que posibiliten la detección temprana de una reactivación de la infección implementando el tratamiento específico en forma rápida, evitando así el compromiso del SNC

19 Métodos de Diagnóstico de Laboratorio Parásitos Anticuerpos Métodos Inmunoserológicos Métodos Parasitológicos

20 Métodos parasitológicos Demostración directa de parásitos Amplificación Demostración indirecta de parásitos

21 Métodos parasitológicos Demostración directa de parásitos S A N G R E T E J I D O S 1. Biopsias de lesiones cutáneas 2. Biopsias de ganglio linfático 3.Necropsias Gota Fresca Concentración Micrométodos de capilares Micrométodo del INP Strout

22 Tubo Eppendorf de 1,5 ml de capacidad una gota de heparina + 0,5 ml de sangre venosa mezclar por inversión centrifugar 1 minutos a 3000 rpm tomar un a gota de la interfase ( glóbulos blancos) Colocar cubre objeto NUEVO MICROMETODO DE RISSIO AM, MAIDANA C, MARTIN GARCIA M Y RUIZ AM Medicina Vol 59 Supl III

23 Leer al microscopio con 400 aumentos durante 30 minutos cada preparado. Se debe realizar cuatro preparado por paciente. Trypomastigotes metacíclicos

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25 CORRELACIÓN ENTRE LOS RESULTADOS OBTENIDOS POR EL MICROMÉTODO Y EL XENODIAGNÓSTICO Micrométodo Xenodiagnóstico PositivoNegativoTotal Positivo15116 Negativo0383 Total Concordancia entre ambos métodos: 99.7% Sensibilidad del Micrométodo: 94% Tasa de incidencia por Micrométodo: 3.8% Tasa de incidencia por Xenodiagnóstico: 4%

26 Strout 8-10 ml de sangre sin anticoagulante Dejar retraer el coágulo Centrifugar 3 minutos a 160 G (800 rpm) Centrifugar 5 minutos a G ( rpm) Se observa el sedimento entre porta y cubreobjeto en microscopio con 400x

27 Métodos parasitológicos Amplificación Sangre con Guanidina PCR (Reacción en cadena por ADN polimerasa) Demostración indirecta de parásitos Enriquecimiento Hemocultivo S: 99.7% < 20% Xenodiagnóstico S: 100% 45-50% Inoculación en animales sensibles

28 Reacción en Cadena por ADN Polimerasa PCR en la Enfermedad de Chagas Aplicación en Enfermedad de Chagas Investigación a nivel molecular Epidemiología : Identificación y caracterización de cepas Diagnóstico : Monitoreo en tratamientos antiparasitario Diagnóstico en pacientes inmunosuprimidos: SIDA, Transplantados y otros Diagnóstico perinatal Incrementar la sensibilidad de los métodos parasitológicos ya estandarizados

29 Reacción en Cadena por ADN Polimerasa PCR en la Enfermedad de Chagas Estado Actual de Desarrollo de la PCR permite: Resultados rápidos Define casos Dudosos Confirma ausencia de infección Expectativas Cuantificación de la parasitemia (PCR Real time) Pronóstico evolutivo de la infección por determinación directa de los clones infectantes

30 Métodos serológicos Técnicas Aglutinación Ensayoinmunoenzimático Inmunofluorescencia Indirecta cuantitativa Inmunofluorescencia Indirecta cuantitativa Aglutinación directa Aglutinación pasiva Hemoaglutinación Indirecta cuantitativa gelatina polimerizada De partículas

31 ANTIGENOS REACCIONES DE AGLUTINACION: Suspensión de formas epimastigotes de cultivo de T. cruzi Sobrenadante de un lisado crudo total de epimastigote de T. cruzi Péptidos de la secuencia antigénica del T. cruzi ENZIMOINMUNOENSAYO: Moléculas solubles obtenidas por ruptura de los parásitos enteros Purificados por distintos medios (anticuerpos monoclonales, fracciones celulares) Técnica de ADN recombinante a partir de proteínas específicas de los estadíos epimastigote y tripomastigote del T. cruzi INMUNOFLUORESCENCIA: Epimastigote de cultivo axénicos tratados con formol

32 Partículas de gelatina Ag de Trypanosoma cruzi inactivado + Ac Anti-T. cruziAGLUTINACIÓN

33 Partículas Polimerizadas Péptidos de la secuencia antigénica del T. cruzi

34 Reacciones Serológicas EnzimoinmunoensayoHemaglutinación Indirecta Inmunofluorescencia

35 Epimastigotes de Trypanosoma cruzi por Inmunofluorescencia

36 Duplas serológicas HAI-ELISA HAI-IFI ELISA-IFI Sensibilidad: 99,8%

37 Inmunodiagnóstico - Criterio de elección (Duplas serológicas) ¨ Screening¨ o ¨Descarte¨ Banco de sangre Epidemiología ¨Confirmación¨ Consulta clínica y/o cardiológica Embarazadas Grupo familiar Banco de sangre Politransfundidos Preocupacionales Migraciones Donantes y receptor de órganos

38 ¨ Screening¨ o ¨Descarte¨ Control de los donantes de sangre y de la sangre a transfundir - Todos los dadores de sangre deben ser estudiados serológicamente para Chagas. -Cuando se obtengan resultados reactivos por 1 o 2 métodos de descarte se deberá desechar la bolsa de sangre. -El Laboratorio que realice la selección o descarte de las muestras reactivas, debe derivar al dador encontrado reactivo al Laboratorio de Referencia para confirmar o descartar infección. A aquellas reacciones que permiten identificar rápidamente los sueros reactivos y que ofrecen un margen de seguridad en la detección Métodos: HAI y ELISA (Títulos de corte correspondientes para screening o descarte según indique el productor del reactivo)

39 Análisis de los Resultados del Inmunodiagnóstico Pruebas Serológicas efectuadas: ELISA- HAI / ELISA-IFI / HAI-IFI Resultados : Reactivo ( con títulos obtenidos) o No Reactivo Interpretación de los Resultados : El Inmunodiagnóstico se considerará Reactivo cuando por lo menos dos pruebas serológicas son Reactivas.

40 Diagnóstico Referencial n = 83507

41 Diagnóstico Referencial n = 83507

42 Diagnóstico Referencial n = 83507

43 Control de Calidad Informe de Resultados Totales país, Jurisdicciones del país, respondieron 23 Panel de 4 muestras de Suero Control liofilizado, 2 Reactivos (Alta y Baja reactividad) y 2 No Reactivos Instructivo Planilla para informe de resultados Se enviaron 506 Paneles de Control Se recibieron 396 respuestas (78%) Análisis de Resultados: Fueron agrupados por pruebas serológica empleada (Aglutinación y ELISA para T. cruzi) sin diferenciar marcas o lotes de equipos usados para las 4 muestras de control. Los resultados se expresan como N° de aciertos / N° de respuestas Fuente: Dra. Estela N. Cura, Centro Nacional de Control de Calidad de Biológicos- ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán

44 Resultados del Control de Calidad Externo de la Red de Chagas, período Fuente: Dra. Estela N. Cura, Centro Nacional de Control de Calidad de Biológicos- ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán Resultados obtenidos con pruebas de Aglutinación (diferentes marcas y lotes), por el conjunto de los Laboratorios Participantes. Muestra 1 (Suero Control No Reactivo) Muestra 2 (Suero Control Reactivo, alta reactividad) Muestra 3 (Suero Control Reactivo, baja reactividad) Muestra 4 (Suero Control No Reactivo) N° de Aciertos / N° de respuestas 355 / / / / 387 Concordancia de resultados ( % )

45 Resultados del Control de Calidad Externo de la Red de Chagas, período Fuente: Dra. Estela N. Cura, Centro Nacional de Control de Calidad de Biológicos- ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán Resultados obtenidos con pruebas de ELISA (diferentes marcas y lotes), por el conjunto de los Laboratorios Participantes. Muestra 1 (Suero Control No Reactivo) Muestra 2 (Suero Control Reactivo, alta reactividad) Muestra 3 (Suero Control Reactivo, baja reactividad) Muestra 4 (Suero Control No Reactivo) N° de Aciertos / N° de respuestas 348 / / / / 351 Concordancia de resultados ( % )

46 Conclusiones Con las pruebas de Aglutinación se encontró mayor proporción de Falsos Positivos para muestras No Reactivas (92 y 98%) que con pruebas de ELISA (99%). Los Falsos Negativos hallados con el suero Reactivo con baja reactividad fue del 2% para pruebas de Aglutinación y del 1% para ELISA. Esto aporta justificación al empleo de la dupla serológica según Normas N° 523/97 Para pruebas de IFI y Aglutinación de Partículas de Gelatina todos los participantes obtuvieron el 100% de aciertos con las 4 muestras.

47 Control de la Mujer Embarazada Infectada – Seguimiento del RN Laboratorio Departamento de DIAGNOSTICO INP Dr. Mario Fatala Chabén 800 mujeres embarazadas ( 50% Reactivas) Chagas Congénito 20 – 25 casos Tasa de Incidencia 6.3%

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54 Algoritmo del recién nacido, hijo de madre chagásica 1er control días 2do control 6 meses 3er control 12 meses serológico parasitológico Diagnóstico de certeza serológico parasitológico Positivo Tratamiento No reactiva Reactiva ( Tìtulos al titulo basal) serológico parasitológico Positivo Tratamiento

55 DIAGNOSTICO DE LA INFECCION CONGENITA Detección de Ac IgM contra Trypanosoma cruzi madiante el uso de Ag recombinantes. **LA IgM NO SIEMPRE SE DETECTA** CAUSAS: La infección es muy reciente o se produjo en el canal de parto La infección ocurrió tempranamente por Ej durante el primer trimestre Existe exceso de IgG materna, por lo tanto se suprime la síntesis de IgM específica. El bebe no tiene respuesta inmune normal Por lo tanto: La falta de anticuerpos IgM contra Ag derivados de epimastigotes de T. Cruzi no excluye la posibilidad de infección

56 AñoTotal de niños estudiados Total de niños Detectados(+) Tasa de incidencia % % % % % % % % % % % TOTAL % TRANSMISION VERTICAL - TASA DE INCIDENCIA PERIODO

57 TRANSMISION CONNATAL DISTRIBUCION DE POSITIVIDAD EN LA POBLACION INFANTIL SEGUN LA EDAD EN EL PRIMER CONTROL EdadNº de NiñosPorcentaje % Hasta 1 Mes14956% 2 Meses y 5 Meses 6825% 6 Meses y 12 Meses 5319% TOTAL267100%

58 INCIDENCIA DE PARASITEMIA POR TRYPANOSOMA CRUZI Y DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS EN NIÑOS 6 MESES Y 12 MESES QUE CONCURRIERON AL PRIMER CONTROL Edad Parasitemia (+) Parasitemia (-) TotalSerología Reactiva Serología No Reactiva Serología Discordante (aIFI+) TOTAL 6 Meses %630%315%20 7 Meses %638%212%16 8 Meses %1 00%2 9 Meses %225%2 8 10Meses %00%0 3 11Meses %00%125%4 12Meses %00%16%16 TOTAL %1421%1014%69-100%

59 COMPORTAMIENTO DE LOS ANTICUERPOS ESPECIFICOS EN NIÑOS HIJOS DE MADRE CHAGASICA AL 6° MES SIN TRANSMISION CONNATAL AÑON° NIÑOSELISA/HAIELISA/IFIHAI/IFIDISCORDANTE 2NR/1R TOTAL TOTAL % % 3 0.4% % %

60 El Diagnóstico de infección chagásica en la embarazada es requisito previo para la sospecha de infección potencial del feto o del RN. La detección de la infección en el RN es de suma importancia para la implementación temprana y eficaz del tratamiento. Los métodos actuales, empleados para el Diagnóstico de certeza necesario para el tratamiento del bebé infectado pueden requerir hasta 9 meses. CONCLUSION

61 Actualmente no existen procedimientos para prevenir ni predecir la transmisión del T. cruzi. Propuesta: estudiar la generación de los mediadores que regulan la respuesta inmune como preditores de a infección chagásica

62 Niveles de citoquinas en circulación IL-10 incrementa en la no-embarazada Tc+ y en la embarazada Tc- (* p<0.05, ANOVA de 2 factores). Los niveles de TNF tienden a aumentar por la infección.

63 Niveles plasmáticos de citoquinas Sin trans Con trans Embarazadas infectadas Tc- Tc+ Bebés (* p<0.05, test t)

64 Liberación espontánea de citoquinas, por leucocitos de sangre periférica, de madres con y sin transmisión de la infección Los niveles de TNF fueron mayores en las madres sin transmisión ( * p<0.05, test t) Sin trans Con trans Embarazadas infectadas Sin trans Con trans Embarazadas infectadas Sin trans Con trans Embarazadas infectadas

65 Niveles en circulación de citoquinas en bebés no infectados, hijos de madres infectadas por T. cruzi. ( * p<0.05, test t)

66 Conclusiones Los niveles circulantes de TNF fueron mayores en las mujeres que no transmitieron la infección que en aquellas que si lo hicieron La liberación espontánea de TNF fue mayor en las madres de niños no infectados en comparación con las madres de niños infectados Los hijos no infectados de madres infectadas presentaron mayores niveles plasmáticos de TNF que los infectados.

67 TNF modulado por IL-10 Perspectivas futuras Evaluar la bioactividad del TNF Evaluar los niveles de los receptores sTNF-R 1 y sTNF-R 2 Evaluar la respuesta de los LP de los bebés en presencia de Ag de T. cruzi sTNF-R1 y sTNF-R2


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