PREPARACIONES MICROSCÓPICAS Y OBSERVACIONES DIVERSAS

Presentación del tema: "PREPARACIONES MICROSCÓPICAS Y OBSERVACIONES DIVERSAS"— Transcripción de la presentación:

1 PREPARACIONES MICROSCÓPICAS Y OBSERVACIONES DIVERSAS

2 1.- INTRODUCCIÓN A LA VISUALIZACIÓN DE MICRORGANISMOS.
1.1- REQUISITOS DE UNA PREPARACIÓN PARA LA OBSERVACIÓN CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO. 1.2- CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN DE MICROORGANISMOS EN MICROSCOPIA ÓPTICA. 1.3- CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SEGÚN SU VISIÓN AL MICROSCOPIO. 2.- VISUALIZACIÓN “IN VIVO” 2.1- TÉCNICA 2.2- EXAMEN EN FRESCO 2.3- GOTA PENDIENTE

3 3.1- TÉCNICA GENERAL DE TINCIÓN
3.- OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS MUERTOS. TINCIONES 3.1- TÉCNICA GENERAL DE TINCIÓN 3.2- FACTORES QUE INFLUYEN EN LA TINCIÓN 3.3- PREPARACIÓN DE LOS COLORANTES 3.4- MATERIAL EN LAS TÉCNICAS DE TINCIÓN 3.5- TINCIONES TINCIÓN NEGATIVA TINCIÓN SIMPLE TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES ESTRUCTURALES

4 MICROORGANISMOS VIVOS
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN DE MICROORGANISMOS EN MICROSCOPIA ÓPTICA MICROORGANISMOS VIVOS SIN COLOREAR EXAMEN EN FRESCO ENTRE PORTA Y CUBRE GOTA PENDIENTE EN PORTA EXCAVADO MICROORGANISMOS MUERTOS SIN FIJACIÓN PREVIA TINCIÓN NEGATIVA CON FIJACIÓN TINCIÓN SIMPLE TINCIONES COMPUESTAS TINCIONES DIFERENCIALES GRAM ZHIEL-NEELSEN TINCIONES ESTRUCTURALES FLAGELOS CÁPSULAS ESPORAS

5 MORFOLOGÍA BACTERIANA

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7 VISUALIZACIÓN “IN VIVO”
Muestras delgadas o transparentes Líquidos con pH fisiológicos Ventajas: se aprecia mejor la Morfología Agrupación Motilidad Inconvenientes: Poco contraste Manejo engorroso (materia viva, contaminante)

8 Utilización del microscopio Soporte de los microorganismos:
TÉCNICA Utilización del microscopio Soporte de los microorganismos: suero fisiológico (mantiene la vitalidad) solución de KOH (aumenta la refringencia) agua marina, agua dulce, clara de huevo.. Evitar la desecación (sellado)

9 Objetivos: descritos anteriormente. Técnica: Ventajas:
EXAMEN EN FRECO Objetivos: descritos anteriormente. Técnica: Limpiar porta Colocar vaselina Depositar gota Colocar cubre Observar al M.O. Ventajas: Rapidez Evita las distorsiones ópticas de portas excavados. Desventajas: Poco contraste A veces necesita cámaras para observar la motilidad. Infusiones de hojas (cocos y parásitos), sarro dental (espiroquetas), Yogur (bacilos)

10 OBSERVACIÓN DE BACTERIAS EN FRESCO

11 GOTA PENDIENTE Técnica: a.- Limpiar porta excavado y cubre.
b.- Círculo de vaselina en el cubre c.- Muestra en el cubre d.- Se coloca el portaobjetos e.- Se da la vuelta y se observa Ventajas: se deseca manos Desventajas: más lento y Engorroso.

12 TINCIONES. TÉCNICA Extensión Desecación Fijación Tinción Lavado Secado

13 FACTORES QUE INFLUYEN Pureza de colorantes y reactivos
Concentración del colorante (0,2-2%) pH de la solución del colorante: Ácidos: eosina, azul de metilo, fucsina ácida Básicos: fucsina básica, azul de metileno, verde malaquita, violeta de genciana Neutros Temperatura Sustancias adicionales Tiempo de tinción

14 PREPARACIÓN DE COLORANTES
Se disuelven mal en agua y bien en alcohol. Debe pulverizarse. Muy cuidadosos con las concentraciones. Dejarlos reposar antes de usarlos (24 h). Filtrarlos Etiquetarlos (fecha, composición..). Filtrarlos si aparecen precipitados.

15 MATERIAL PARA TINCIONES
Portas y cubres Asas de siembra Mechero Microscopio Cuentagotas o pipetas pasteur Cristalizador Frasco lavador Barras paralelas

16 TINCIÓN NEGATIVA Rápido Sin fijación Colorea el fondo
Ventajas: morfología externa Inconveniente: no se ve la motilidad Colorante: tinta china o nigrosina al 1% Limpiar porta Colocar gota suspensión y gota de nigrosina Mezclar con el asa Secar a Tª ambiente Observar al M.

17 TINCIÓN NEGATIVA (tinta china)

18 TINCIÓN DE GRAM METODO TAXONÓMICO SOLAMENTE DEBE USARSE EN CULTIVOS JÓVENES. ALGUNAS BACTERIAS SON GRAM (+) SÓLO DURANTE LAS PRIMERAS FASES DE SU DESARROLLO.

19 TINCIÓN DE GRAM (BACILOS)

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21 TINCIÓN DE GRAM

22 TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE

23 TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE
PARA Mycobacterium. PARED MUY RICA EN LÍPIDOS QUE NO SE DECOLORA. AAR: ROJAS: acido resistentes (Mycobacterium) NO AAR: AZUL

24 TÉCNICA EXTENDER, FIJAR, SECAR FUCSINA EN CALIENTE (5-10m) LAVAR DECOLORAR CON ÁCIDO-ALCOHOL AZUL DE METILENO (2-3m)

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26 TINCIÓN DE CÁPSULAS MÉTODO DE ANTHONY
EXTENDER, SECAR NO FIJAR CRISTAL VIOLETA AL 1% (2m) LAVAR CON SULFATO DE COBRE AL 20% Resultado: La capsula de tiñe de AZUL VIOLETA. El resto de AZUL OSCURO.

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28 TINCIÓN DE CÁPSULAS CON TINTA CHINA

29 TINCIÓN DE ESPORAS EXTENDER, FIJAR, SECAR. VERDE MALAQUITA EN CALIENTE. LAVAR SAFRANINA O FUCSINA. LAVAR. Resultado: endosporas teñidas de verde. El resto, rojo.

30 Se introduce el colorante
dentro de la espora, haciendo que luego lo pierda el resto de la célula, y esta se tiñe con un colorante de contraste, como la safranina o fucsina

31 TINCIÓN DE ESPORAS

32 TINCIÓN DE FLAGELOS MUESTRA JOVEN EN AGAR INCLINADO. SOBRE CUBRE.
FIFAR CON VAPOR DE A. ÓSMICO AL 1%. SUSPENDER EN FORMALINA AL 0,5%. DEJAR RESBALAR SOBRE EL PORTA. MORDIENTE DE RHODES. LAVAR POR INMERSIÓN NITRATO DE PLATA AMONIACAL AL 5%, CALENTADO A 95º

33 TINCIÓN DE FLAGELOS

34 TINCIÓN DE FLAGELOS