Técnicas utilizadas en Microbiología

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1 Técnicas utilizadas en Microbiología

2 Técnicas de cultivo Los m.o. generalmente se encuentran como poblaciones mixtas y deben ser aisladas como cultivos puros. Un cultivo puro consiste de una población de células que provienen de una sola célula Técnica de estría en placa Transferencia aséptica de un cultivo Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

3 Técnica de estría en placa
Un cultivo mixto es depositado en un área de una caja petri con agar, con un asa de siembra estéril se estría el agar varias veces. El asa de siembra puede ser esterilizada antes de estriar nuevamente el agar. Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

4 Esas diferencias pueden ayudar en la obtención de cultivos puros
Cuando la técnica de estría en placa ha sido llevada acabo adecuadamente, las células bacterianas se multiplicarán y crecerán en distintas poblaciones o colonias. Las colonias formadas por diferentes bacterias tienen diversas formas, tamaño y pigmentación. Esas diferencias pueden ayudar en la obtención de cultivos puros Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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7 Transferencia aséptica de un cultivo
Este término es utilizado para describir el procedimiento de transferencia de m.o. de un medio de cultivo a otro, de tal forma que se elimine la contaminación por m.o. indeseables. Es importante trabajar rápido y mantener los tubos en un ángulo que impida la entrada de contaminantes con el aire Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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9 Vertido Superficie Pueden ser utilizadas para la obtención
de cultivos puros Vertido Superficie

10 Microscopio Luz (utiliza luz como única fuente de iluminación)
Campo luminoso Campo oscuro Fluorescencia Contraste de fases Electrones (utiliza un haz de electrones en lugar de luz para producir imágenes) Transmisión (TEMs) Escaneo (SEMs) Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

11 Microscopio compuesto
Se conoce como compuesto porque contiene dos o más juegos de lentes. Se distinguen las siguientes partes condensadores (lentes que enfocan la luz al espécimen) objetivos (lentes más cercanos al espécimen) oculares (lentes cercanos al ojo y que magnifican la imagen) Los rayos de luz pasan através del espécimen, debido a que los objetos son vistos con un fondo luminoso, la tinción ayuda al contraste, observándose más oscuros Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

12 Objetivos con diferente poder de magnitud
El aumento total de la imagen será calculado considerando la magnitud de los lentes de ocular y objetivo, por ejemplo 40x, 10x equivale a 400x El enfoque con los objetivos de be estar libre de aberraciones Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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14 Tipos de aberraciones Esférica Cromática
Los haces de luz pasan através del objeto sin coincidir en el punto focal (de mayor claridad), en consecuencia la imagen es borrosa y distorsionada. Cromática Ocurre cuando la luz blanca pasa através del lente y se descompone en diferentes colores del espectro (violeta a roja), la imagen no es clara y es rodeada de espejismos de colores Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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16 Resolución o Poder de resolución
Es la habilidad del microscopio de distinguir dos objetos cercanos y separarlos como entidades distintas. El microscopio compuesto puede distinguir entre especímenes que se encuentran a menos de 0.2 mm. Se determina por tres factores: 1) Longitud de onda de la luz (l), 2) apertura numérica del condensador y 3) apertura numérica del objetivo Poder de Resolución= (0.61)l/ NA objetivos+NA condensadores Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

17 NA= n sinq Donde: n es el índice de refracción del medio entre los objetivos y el espécimen, y q es mitad del ángulo de luz que entra a los objetivos El índice de refracción varía con el medio utilizado entre los lentes y el espécimen, el aire es generalmente usado como un medio estándar con un n=1.00. Para aumentar NA se requiere un medio con n>1.0, i.e. Agua n=1.33, aceite de inmersión n=1.52. Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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19 Microscopio de campo oscuro
Permite la observación de estructuras muy pequeñas como flagelos La luz es enfocada al espécimen en ángulo oblicuo Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

20 Microscopio de contraste de fases
Es posible observar m.o. no teñidos, debido a que el microscopio detecta pequeñas diferencias en los índices de refracción Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

21 Tinción Simple Diferencial Especial
Consiste en el uso de un solo colorante que aumenta el contraste del espécimen contra un fondo. Diferencial Utilización de dos colorantes (el colorante primario tiñe la estructura y el secundario ayuda al contraste). Especial Los colorantes tienen afinidad específica por estructuras celulares Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

22 Reactivos Tiempo Reacciones
Células incoloras difíciles de ver Reactivos Tiempo Reacciones Frotis Cristal Violeta 1 minuto Colorante básico que se une a enjuagar los grupos cargados negativamente con agua de la pared celular, membrana, citoplasma. Yodo-Yoduro 1 minuto Yodo fija el cristal violeta a los grupos enjuagar negativos Alcohol-Acetona 10 a 15 Decolorar el cristal violeta y yodo de segundos las células. El color difunde de los enjuagar m.o. gram positivos más lentamente que con agua negativos, por la composición química y grosor de la pared celular de gram positivos Safranina 1 minuto Colorante básico que se liga a los grupos enjuagar negativos en ambos tipos de células. Unos cuantos grupos negativos están libres del cristal violeta en gram +, mientras que la mayoría de los grupos - están libres en bacterias gram En consecuencia gram+ permaneces violetas mientras que gram -, rojos o rosas Gram+ y -se tiñen azules Gram+ y - se mantienen azules Gram + permanecen azules, gram - se decoloran y son difíciles de ver Gram + las células permanecen violetas, mientrás gram - son teñidas a rosa o rojo.

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24 A. Campo luminoso, B. Campo oscuro, C y D. Contraste de fases.

25 Streptococcus pyogenes, división incompleta (X 40000)
Fuente:Lim, Microbiology. Ed. McGraw-Hill

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27 A. Microscopio de Transmisión B. Microscopio de escaneo
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28 Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa A B C A. Pseudomonas aeruginosa, teñida
con ácido fosfotungstico (x6,450) B. Clostridium tetani, mostrando flagelos sombreado metálico (x4,400) C. Vaccinia virus,sombreado metálico (x60,000) D. Neiseria gonorrhoeae,freeze-etched (x12,300) E. Physarum polycephalum escaneo electrónico (x30) D E Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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32 La iluminación se controla mediante la concentración de la luz a la muestra, existen dos tipos de iluminación Crítica Köhler Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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