Resonancia magnética nuclear

Presentación del tema: "Resonancia magnética nuclear"— Transcripción de la presentación:

1 Resonancia magnética nuclear
¿Qué es y para qué sirve? Instrumentación Parámetros de un espectro sencillo de RMN Intensidad (área bajo la curva) Desplazamiento químico (d). Grupos funcionales en 1H RMN Desdoblamiento de señales Tiempos de relajación Espectros bidimensionales Aplicaciones de RMN en bioquímica Cinética y vías metabólicas Unión de ligandos a macromoléculas Modificaciones estructurales de proteínas Determinación de estructuras de macromoléculas.

2 Los núcleos atómicos se comportan como pequeños imanes
sin campo con campo

3 En presencia de un campo magnético se separan dos estados energéticos

4 Propiedades de algunos núcleos atómicos
Isótopo Abundancia natural (%) número cuántico de spin (I) Momento magnético (μ) Frecuencia de resonancia a 7 T (MHz) Sensibilidad relativa 1H 99.984 1/2 300.13 1.0000 2H 0.016 1 46.07 0.0964 12C 98.9 13C 1.1 75.47 0.0159 14N 99.64 21.68 15N 0.37 − 30.41 16O 99.76 17º 0.0317 5/2 −1.8930 40.69 0.0291 19F 100 2.6273 282.40 0.834 28Si 92.28 31P 1.1205 121.49 0.0664

5 Equipo básico de RMN Control y registrador transmisor de
radiofrecuencia Control y registrador receptor de radiofrecuencia Polo del imán Bobinas de barrido Generador Tubo de muestra

6 Parámetros de un espectro de RMN
1) Intensidad (área bajo la curva). Es proporcional al número de protones que dan origen a la señal

7 Parámetros de un espectro de RMN
2) Desplazamiento químico (d) Es producto del campo magnético inducido por los electrones vecinos al núcleo

8 Parámetros de un espectro de RMN
2) Desplazamiento químico (d) desprotegido protegido campo bajo campo alto

9 Parámetros de un espectro de RMN
2) Desplazamiento químico (d)

10 Parámetros de un espectro de RMN
2) Desplazamiento químico (d) Observaciones: Los grupos electronegativos “desprotegen” a los núcleos y tienden a desplazar las señales a “campo bajo” (a mayores valores en ppm) Los protones unidos a O y N tienen desplazamientos químicos muy variables que son sensibles a la concentración (formación de puentes de hidrógeno) a la temperatura y al disolvente (fenómenos de intercambio químico). Los sistemas p desprotegen mucho a los protones que tienen unidos y tienden a desplazar las señales a “campo bajo” (a mayores valores en ppm)

11 Parámetros de un espectro de RMN
3) Desdoblamiento de señales (acoplamiento spin-spin) núm. de vecinos 1 2 3

12 Parámetros de un espectro de RMN
3) Desdoblamiento de señales (acoplamiento spin-spin) singulete doblete triplete cuarteto Sin hidrógenos acoplados doblete triplete cuarteto Triángulo de Pascal Un hidrógeno acoplado Dos hidrógenos acoplados Tres hidrógenos acoplados

13 Parámetros de un espectro de RMN
4) Tiempos de relajación El término relajación describe varios procesos por los cuales la magnetización de un estado fuera del equilibrio regresa a la distribución de equilibrio. Es decir, la relajación describe qué tan rápido los spines nucleares “olvidan” la dirección en que estaban orientados. Las velocidades de esta relajación de spines se puede medir y tiene aplicación en espectroscopía y en obtención de imágenes.

14 Interpretación de espectros simples de 1H RMN
Qué se puede obtener del espectro: 1- ¿Cuántos tipos de H hay? – Indicado por cuántos grupos de señales hay en el espectro 2.- ¿Qué tipos de H ? – Indicados por los desplazamientos químicos de cada grupo 3.- ¿Cuántos H hay de cada tipo? – Indicados por la integración de la señal de cada grupo 4.- ¿Cuál es la conectividad? – A través de los patrones de acoplamiento sabemos qué grupo es vecino de qué grupo.

15 Algunos ejemplos de espectros e interpretación

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17 Algunos ejemplos de espectros e interpretación

18 Nueve líneas, las de los extremos son demasiado pequeñas y no se ven
Molécula con un alqueno terminal Molécula con un patrón de desdoblamiento de 9 líneas Nueve líneas, las de los extremos son demasiado pequeñas y no se ven

19 Un poco más complicado: 2D C4H8O: COSY
OH CH2 CH3 CH3 – CH2 – CH2 – OH

20 Unión de ligando a ADN Robinson, H. and A. H. Wang (1996). Nucleic Acids Res 24(4): Usan 1H RMN para estudiar las transiciones estructurales en el polinucleótido dúplex A2G15C15T2 en presencia de la sonda catiónicas Co(NH3)63+. Las figuras muestran dos secciones del espectro donde se ven algunos de los protones de las bases en presencia de Co(NH3)63+ en diferentes relaciones de concentración respecto al ADN.

21 Unión de ligando a proteína
19F RMN de una proteína intestinal de unión a ácidos grasos. La proteína se preparó con ocho residuos de 4-19F-fenilalanina, los números de residuo son los que aparecen arriba de los picos en los espectros. El espectro de arriba (holo) corresponde a la proteína unida a una molécula de ácido oleico, mientras que el espectro de abajo (apo) es el de la proteína sin ligandos.

22 Modificación de proteínas
Lisozima intercambiada con deuterio Lisozima sin intercambio (1H) Lisozima precipitada en D2O con un desnaturalizante suave Chang, S.T. et al (1998) Biotech. and Bioeng. 59:144.

23 Modificación de proteínas
Lisozima intercambiada con deuterio Lisozima sin intercambio (1H) Lisozima precipitada en D2O con un desnaturalizante suave Chang, S.T. et al (1998) Biotech. and Bioeng. 59:144.

24 Desnaturalización de proteína
Cu-Zn SOD sometida a diferentes concentraciones de SDS. 1H RMN, en a sin SDS y en b con 5% de SDS. Los espectros muestran las regiones de protones aromáticos y de amida ( ppm), y de protones de carbono alfa y metínicos (< 5.8 ppm). Int. J. Biol Macromol (2001) 29;

25 Unión de ligando a proteína
1H RMN de insulina. Región de los protones de residuos aromáticos con diferentes concentraciones de ion cinc agregado. Los números indican las veces en exceso que se encuentra el Zn2+.

26 Unión de ligando a proteína
Zhuang, Z, et al (2002) Biochemistry, 41, NMR de 4-Hidroxibenzoil-CoA tioesterasa

27 Propiedades de aminoácidos en proteínas
1H RMN de la proteína nucleocápside HIV-1 (Bombarda, E. et al (2001) J Mol Biol 310, 659). Los diferentes puntos representan los protones del Cb de la Cys36 (▲), Cys39 (● y ♦) y Cys49 (■)

28 Cinética enzimática 31P RMN ( J. Biol. Chem. (1996) 45; ). Mezcla de reacción que contiene inicialmente ATP, GMP y guanilato quinasa (GK) (espectros a, b, c, d) o bien ADP, GDP y GK (espectros e, f, g, h) y cuyo cambio se observa en el tiempo.