Unidad de Investigación, Servicio de Nefrología. CÓRDOBA

Presentación del tema: "Unidad de Investigación, Servicio de Nefrología. CÓRDOBA"— Transcripción de la presentación:

1 Unidad de Investigación, Servicio de Nefrología. CÓRDOBA
MECANISMOS INTRACELULARES IMPLICADOS EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE RECEPTOR DE VITAMINA D (VDR) POR CALCIO EXTRACELULAR EN GLÁNDULAS PARATIROIDES. ESTUDIOS “IN VITRO”. Cañadillas S, Almadén Y, Canalejo R, Rodríguez ME, Quintero A, Pérez J, Rodríguez M.

2 AA INTRODUCCIÓN Ca2+ CaR Cai G ARNmVDR CÉLULA PARATIROIDEA PLA2 Núcleo
ERK1/2MAPK AA Núcleo ARNmVDR En la célula paratiroidea, un aumento en la concentración de Ca extrac, se traduce, a través de la activación del CaR en un incremento en los niveles de Cai. El Cai activa a la fosfolipasa A2 la cual sintetiza AA. Estudios prelimirares en nuestro laboratorio demuestran que el AA no solo participa como mediador en la inhibición de la secreción de PTH, si no que tb, regula positivamente la expresión génica de receptor de vitamina D VDR. Por otro lado, también hemos demostrado que la activación del CaR, como es característico de este tipo de receptores, conduce a la estimulación de una proteína de la familia de la MAPKs denominada ERK1/2-MAPK. La MAPKs son proteínas de señalización que controlan diversas funciones celulares. Concretamente, en la célula paratiroidea, nuestros datos demuestran que ERK-MAPK participa en las señales intracelulares inducidas por alto Ca que conducen a la expresión de VDR y a la inhibición de la secreción de PTH (la regulación por Ca extrac de la expresión de VDR y de la secreción de PTH) PTH CÉLULA PARATIROIDEA

3 ? AA HIPÓTESIS Ca2+ CaR Cai G ARNmVDR PLA2 Núcleo ERK1/2MAPK
En base a esto se planteó la siguiente hipótesis: Si condensamos toda la información que tenemos, se observa que la activación del CaR genera señales intracelulares que hemos demostrado que activan la vía de señalización PLA2-AA, así como la actividad ERK-MAPK. Si prestamos atención, ambas señales intracelulares se activan con el Ca extracelular y dan lugar a la misma respuesta celular, un aumento en la expresión génica de VDR y la inhibición de la secreción de PTH. Por lo tanto sería lógico pensar que exista una conexión entre ambos mediadores intracelulares. PTH Núcleo ARNmVDR

4 OBJETIVO Evaluar si el efecto del AA sobre la secreción de PTH y sobre la expresión génica de VDR es dependiente de la actividad de ERK1/2-MAPK. Cai CaR PLA2 G ? AA ERK1/2MAPK Para verificar esta hipótesis nos planteamos el siguiente objetivo de trabajo. (leo) y clik cdo llego a ERK1/2MAPK Núcleo ARNmVDR PTH

5 ? DISEÑO EXPERIMENTAL Ca2+ Cai AA exógeno CaR
[Ca2+] = 0.6mM +AA (20μM) Ca2+ Cai CaR PLA2 G Inhibidor de ERK1/2 (PD98059) ? AA exógeno AA ERK1/2MAPK Para abordar este objetivo se empleó el siguiente diseño experimental. Se utilizaron glándulas paratiroides de rata que se incubaron en una situación de bajo Ca en presencia de AA. El hecho de incubar las glándulas en bajo Ca tiene como finalidad aislar el efecto del AA. De esta manera en Ca 0.6mM el CaR así como la señal Cai-PLA2 se encuentran inactivas. En esta situación se añade AA exógeno que como hemos demostrado previamente participa en la inhibición de la secreción de PTH y en la regulación de la expresión de VDR. Para evaluar si en el efecto del AA depende de ERK1/2 se añade al medio de cultivo un inhibidor específico de la misma con el objeto de detectar si su inhibición altera la respuesta celular inducida por AA. Núcleo ARNmVDR PTH

6 DISEÑO EXPERIMENTAL PTH secretada IRMA Expresión ARNmVDR RT-PCR
Transcurridos los períodos de incubación Los niveles de PTH secretada en el medio de cultivo se determinaron mediente ensayo inmuradiométrico. La expresión de VDR en el tejido incubado se determinó por RT-PCR y se cuantificó por detección génica inducida por láser en genescan RT-PCR GENESCAN

7 1. Participacion de la actividad ERK1/2-MAPK en la inhibicion de la secrecion de PTH por AA.
1 hora Ca=0.6mM Ca=1.5mM Ca=0.6mM+AA (20µM) Ca=0.6mM+AA PD (50μM) % PTH vs máxima (0.6mM) b c Sin ERK 120 a p<0.01 vs 0.6mM 100 b p<0.01 vs 0.6mM+AA 80 a 60 a En primer lugar se evaluó (leo)… Para ello se incubaron glándulas parat de rats… Los resultados aparecen reflejados en la siguiente gráfica. En el eje vertical se representa la secreción de PTH c p<0.01 vs 1.5mM 40 20 [Ca] 0.6mM [Ca] 1.5mM [Ca] 0.6mM +AA [Ca] 0.6mM +AA +PD

8 2. Participacion de la actividad ERK1/2-MAPK en la regulación de la expresión de ARNmVDR por AA.
6 horas Ca=0.6mM Ca=1.5mM Ca=0.6mM+AA (20µM) Ca=0.6mM+AA PD (10µM) %ARNmvdr / β-actina vs Ca=0.6mM 240 a a p<0.01 vs 0.6mM 200 a b c Sin ERK b p<0.01 vs 0.6mM+AA 160 120 c p<0.01 vs 1.5mM 80 40 [Ca] 0.6mM [Ca] 1.5mM [Ca] 0.6mM +AA [Ca] 0.6mM +AA +PD

9 AA Ca2+ Cai PD PD ARNmVDR G PLA2 Núcleo ERK1/2MAPK PTH PTH
En definitiva nuestros resultados sugieren que la activación del CaR se traduce en un incremento en los niveles de Cai que activa la vía de señalización PLA2-AA. El AA a través de mecanismos intracelulares dependientes de ERK1/2-MAPK inhibe la secreción de PTH y estimula la síntesis de ARNmVDR. Este hecho se constata cuando el efecto inhibidor del AA sobre la secreción desaparece en presencia del inhibidor de ERK1/2-MAPK aumentando la secreción en el medio. De forma similar en presencia de este inhibidor se interrumpe la comunicación del AA con el núcleo reduciéndose los niveles de expresión de ARNmVDR PTH PTH ARNmVDR PTH Núcleo PTH PTH PTH PTH

10 3. Efecto del AA sobre la activación (fosforilación) de ERK1/2-MAPK
CaR ? Ca2+ PTH ERK1/2 MAPK PLA2 - AA P ARNmvdr Ca=0.6mM Ca=1.5mM Ca=0.6mM+AA Una vez obtenidos los datos presentados anteriormente, el siguiente paso en nuestra investigación fue (leo). Hasta ahora hemos visto que la estimulación del CaR activa la vía de señalización PLA2-AA. El AA inhibe la secreción de PTH y regula al alza la expresión de VDR a través de mecanismos intracelulares dependientes de la actividad ERK-MAPK. Nuestros resultados sugieren que el AA induce la activación (fosforilación) de ERK-MAPK. Para comprobar este hecho se realizó un experimento en el que se evaluó el efecto del AA sobre la actividad ERKMAPK mediante análisis inmunohistoquímico. Para ello, se incubaron gl. Parat. de rata en presencia de AA y como controles se incubaron glándulas en alto y bajo calcio, transcurrido el período de incubación se procedió al análisis inmunohistoquímico en el que se utilizó un anticuerpo que se une específicamente a la proteína ERK fosforilada. Inmunohistoquímica. Ac. Anti-Fosfo-ERK1/2

11 Células positivas ERK1/2-MAPK activa
Ca = 1.5mM Ca = 0.6mM Células positivas ERK1/2-MAPK activa Las tres imágenes que aparecen en la diapositiva son representativas de cada tratamiento. En color marrón se distinguen las células que presentaron actividad ERK-MAPK. En estas imágenes se observa que la adición de AA en bajo Ca provocó un incremento en la actividad ERKMAPK (En marrón) que fue significativo con respecto a la actividad encontrada en células incubadas al mismo nivel de Ca en ausencia de AA. No obstante la actividad encontrada en presencia de AA no fue de igual magnitud a la obtenida en alto calcio Ca = 0.6mM + AA

12 CONCLUSIÓN En glándulas paratiroides de rata, el efecto del AA sobre:
1) Secreción de PTH 2) Síntesis de ARNmVDR es dependiente de la actividad ERK1/2- MAPK. De este modo podemos concluir que (leo)

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MECANISMOS INTRACELULARES IMPLICADOS EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE RECEPTOR DE VITAMINA D (VDR) POR CALCIO EXTRACELULAR EN GLÁNDULAS PARATIROIDES. ESTUDIOS “IN VITRO”. Cañadillas S, Almadén Y, Canalejo R, Rodríguez ME, Quintero A, Pérez J, Rodríguez M.