Universidad del Mar Puerto Escondido

Presentación del tema: "Universidad del Mar Puerto Escondido"— Transcripción de la presentación:

1 Universidad del Mar Puerto Escondido
Minipreps: plásmidos de DNA Addy Guzmán Chávez Francisco Javier Naranjo Luna Ingeniería Genética

2 Minipreps: plásmido de DNA
Presenta 2 procedimientos basados en su velocidad y su éxito: Miniprep de lisis alcalina Miniprep por litio Almacenamiento de DNA plasmidico

3 ANTECEDENTES El aislamiento de plásmidos de DNA de células bacterianas es importante para el análisis de clones. Muchos protocolos para la elaboración de Minipreps son utilizados. Los procedimientos presentados permiten la recuperación de plásmido de DNA circular sobre el DNA cromosómico lineal. Se presenta dos métodos fiables y más utilizados (lisis alcalina y Minipreps en litio. La elección del método esta en función de: La experiencia del investigador. Por las preferencias personales, así como el tamaño y tipo del plásmido que se requiera.

4 ANTECEDENTES Los tres métodos proporcionan plásmidos de DNA con rendimiento y calidad adecuada. El rendimiento del ADN está determinado más por el tipo de plásmido que por el método de aislamiento. Los tres métodos son eficaces para el aislamiento de pequeños plásmidos (< 10 kb).

5 Miniprep de lisis alcalina
Es el procedimiento mas comúnmente usado. El plásmido es preparado de pequeñas cantidades de muchos cultivos diferentes de bacterias conteniendo plásmidos. Las bacterias son lisadas por un tratamiento con una solución de SDS y NaOH.

6 Miniprep de lisis alcalina
La mezcla es neutralizada con acetato de potasio, haciendo que el DNA plasmidico covalente se cierre rápidamente. Mas de DNA cromosómico y bacterial precipitan proteínas y son removidas por centrifugación. EL DNA del plásmido removido del sobrenadante se concentra por la precipitación de etanol.

7 MATERIALES Medio LB con antibiótico Glucosa/ Tris/ EDTA Buffer TE
Solución de NaOH/SDS Acetato de potasio Etanol al 95 y 70% 10mg/ml DNasa-RNasa Tubos Eppendorfs 1.5 ml

8 PROTOCOLO 2 3 Centrifugar 1.5 ml de cultivo por 20 s a la máxima velocidad hasta formar el pellet. Resuspender el pellet en 100 µl de solución GTE y dejar a temperatura amb x 5 min 1 Inocular 5 ml de medio con una cola colonia bacterial (crecimiento saturado) 4 5 Agregar 150 µl de acetato de potasio y agitar en vortex por 2 s. Agregar 200 µl de NaOH/SDS. Homogenizar golpeando el tubo con el dedo. Colocarlo en hielo por 5 min. 6 Centrifugar x 3 min los restos celulares y el DNA cromosómico 9 8 Centrifugar por 1 min para que se forme el pellet de DNA y RNA plasmidico Quitar el sobrenadante, lavar el pellet con 1 ml de etanol al 70 % y secar a vacio. 7 Transferir el sobrenadante a otro tubo, mezclar con 0.8 ml de etanol al 95% y dejar por 2 min a temperatura amb. hasta pp los ácidos nucleicos 10 Resuspender el pellet en 30 µl TE

9 IMPORTANTE En el Miniprep de lisis alcalina, el tratamiento con SDS y NaOH rompe las células bacterianas. La adición subsiguiente de acetato de potasio realinea covalentemente el DNA plasmidico cerrado, mientras que el DNA cromosómico y las proteínas se encuentran atrapados en un complejo formado entre el potasio y el SDS.

10 PROBLEMAS Y SOLUCIONES
El aislamiento exitoso dependerá de la cepa. Contaminación por DNasa y RNasa, lo cual se evita utilizando cantidades bajas de la enzima. El rendimiento de la lisis alcalina se puede aumentar usando 500 mg/ml de lisozima en el paso 3 del protocolo.

11 MINIPREPS POR LITIO El plásmido es obtenido de cultivos en sólido o líquido de E. coli. Las células son secuencialmente tratadas con Triton X-100/LiCl y fenol/cloroformo. Se solubiliza el plásmido de DNA mientras que el DNA Cromosómico se precipita junto con los desechos. Los desechos se remueven con centrifugación.

12 MINIPREPS POR LITIO Esto produce los procedimientos de aislamiento del plásmido de DNA que son virtualmente desprovistos de DNA cromosómico. La ventaja de esta técnica es por ser fiable de rápida. La preparación del plásmido tienen una pureza y calidad que pueden emplearse en la mayoría de sus aplicaciones.

13 MATERIALES Solución TELT Medio LB con antibiótico
1:1 (w/v) fenol/cloroformo Etanol al 100% prerefrigerado a -20ºC Buffer TE *10 mg/ml Dnasa libre de Rnasa A Tubos Eppendorf de 1.5ml

14 PROTOCOLO 13 Se aísla el DNA plasmidico de colonias en crecimiento en agar Con una microespatula, se toma una colonia de 2 a 5 mm de la caja de con agar Colocarla en un tubo de microcentrifuga conteniendo 100 µl de TELT. Agitar en el vortex para homogenizar la colonia en el TELT. TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.

15 PROTOCOLO 23 Se aísla el DNA plasmidico de colonias en cultivo líquido Inocular una colonia bacterial en 1.8 ml de medio LB con antibiótico. Incubar con agitación de 18 a 24 horas a 30 º C. Trasferir cuidadosamente en un tubo Eppendorf. Centrifugar a 10,000 rpm durante 20 s. Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur conectada una línea de vacio. Agregar 100 µl de TELT y agitar en vortex por 5 s. TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.

16 Agregar 100 µl 1:1 de fenol/cloroformo y agitar 5 s en vortex.
PROTOCOLO 3 Agregar 100 µl 1:1 de fenol/cloroformo y agitar 5 s en vortex. Centrifugar 1 min a 15,000 rpm Retirar cuidadosamente 75 µl de sobrenadante y trasferir a un tubo nuevo. Lavar el pellet con 1 ml de etanol al 100% frío y mezclar con el pellet. Repetir los dos pasos anteriores. Quitar el sobrenadante por decantación. El tubo debe quedar casi seco, retirar restos cuidadosamente con papel absorbente. Al resto del sobrenadante agregar 150 µl de etanol al 100% frio, mezclar con el precipitado del plásmido de DNA. Disolver el pellet en 30 µl de TE. Agitar en vortex . Usar 2 o 5 µl de solución de DNA en una solución de 20 µl. Tapar el tubo. Y abrir un pequeño agujero . Y colocar la muestra en un desecador con vacio hasta que este completamente seco. TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.

17 IMPORTANTE El tratamiento con Triton X-100/LiCl el cual actúa en la membrana interna. Este no tiene ningún efecto sobre la morfología general de las células, ni tampoco lleva a la liberación de DNA plasmidico de las células. La adición subsiguiente de fenol/cloroformo, conduce a la desnaturalización y precipitación de las proteínas intracelulares.

18 IMPORTANTE La contracción rápida de las células expulsa el DNA plasmidico en el medio, sin perder el DNA cromosómico. Las proteínas celulares desnaturalizadas se quedan con la masa celular. La morfología bacteriana, de la dotación de la pared celular, se mantiene en estas condiciones durante al menos 30 minutos, al punto que se deriva la lisis celular. El DNA cromosómico se retira con los restos celulares por centrifugación, el ADN plasmidico superenrollado se concentra por precipitación con etanol.

19 ALMACENAMIENTO DE PLÁSMIDOS
Se conserva por periodos cortos (1 mes) en cepas a 4º C. El almacenamiento permanente es muy complejo, el plásmido puede hacerse crecer en presencia de saturación del agente selectivo apropiado. En un volumen igual se separa la muestra en viales estériles y se agrega glicerol o una solución base DMSO y se refrigera a -70ºC Los plásmidos de DNA pueden ser almacenados en un TE a 4º C por varias semanas o presérvalo por varios años por congelación de -20ºC a -70ºC.

20 REACTIVOS Y SOLUCIONES
Solución NaOH / SDS Solución de Acetato de potasio 5M, pH 4.8 Solución de Glucosa / Tris / EDTA (GTE) 0.2 N NaOH 1% sulfato dodecil de sodio Preparas justo a su uso 50 mM glucos 25 mM Tris·Cl, pH 8 10 mM EDTA Esterilizar y guardar a 4ºC 29.5 ml ác. Acético glacial Pellets KOH a pH 4.8 100 ml H2O Mantener a Tº Ambiente no esterilizar Solución de STET Solución TELT Sacarosa al 8% Tritón X-100 al 5% 50 mM EDTA 50 mM Tris·Cl, pH 8 Esterilizar por filtración y guardar a 4ºC 2.5 M LiCl 50 mM Tris·Cl, pH 8 62.5 mM Na2 EDTA Tritón X-100 al 4% Guardar alicuotas con 1-5 ml a -20ºC, no esterilizar

21 PROBLEMAS Y SOLUCIONES
Más breve que otros Minipreps de DNA. El resultado de calidad obtenido por este método ha sido verificado por el hecho de que no se encuentran problemas en lo que respecta a la inhibición de algunas actividades de las enzimas de restricción sensibles. Cualquier inhibición de la fragmentación del DNA es probable que sea debido a la contaminación del DNA con los restos celulares en la fase fenol / cloroformo. esto puede ser fácilmente superado por la reducción del volumen de DNA en la mezcla de reacción.

22 Wiley & Sons. 1987. Current Protocols in Molecular Biology.

23 NO!!! Gracias!! Dudas???

24 REFERENCIAS Wiley & Sons Current Protocols in Molecular Biology.