Impact factor 2010: 31.152 5-Year Impact Factor: 32.628 Issues per year: 26.

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1 Impact factor 2010: 5-Year Impact Factor: Issues per year: 26

2 OBJETIVOS Demostrar que la replicación del DNA en mamíferos es bidireccional, con la formación de fragmentos de Okazaki en una de las cadenas (síntesis discontinua). Los fragmentos de Okazaki cambian de una cadena a otra dentro de un Origen de Replicación Bidireccional (OBR) Vaughn et al. (1990) described convincing evidence for the surprising conclusion that the DNA replication origin located downstream of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene in Chinese hamster cells consists of a broad initiation zone extending over 26 kb. However, the data presented by Burhans et al. (1990) in this issue suggest the contradictory conclusion that replication forks must emanate bidirectionally from a site that is no larger than 450 nucleotides. Identificar un OBR cerca del gen de DHFR.

3 FIGURE 1: PROTOCOLO EXPERIMENTAL
BrdUTP: 5 - Bromo - 2’ - deoxyuridine 5’ - triphosphate BrdU = Bromodeoxyuridine

4 FIGURE 2: MAPPING ORIGINS OF REPLICATION

5 Broad peak of low MW DNA (average 105 nt, range 40-250 nt)
FIGURE 3: PULSE AND CHASE Heat denaturation Alkaline denaturation High MW DNA Características fragmentos de Okazaki: Longitud en aprox. mamíferos: nucleótidos. Naturaleza transitoria (son rápidamente unidos a la cadena naciente). Mayoritariamente en la cadena retrasada. Broad peak of low MW DNA (average 105 nt, range nt)

6 FIGURE 4: HIBRIDACION Y CLONADO EN COSMIDOS
Buscando el origen de replicación… Hibridación usando como sonda los fragmentos de Okazaki:

7 FIGURE 5: DOT BLOT DOT BLOT

8 FIGURE 6: CUANTIFICACION DEL RESULTADO DE DOT BLOT

9 FIGURE 7: ACERCANDOSE AL ORIGEN DE REPLICACION, COMPARACION CON OTROS PAPERS