DIAGNOSTICO SEROLOGICO Ag- Ac..   Empleo de la serología para el diagnostico de enfermedades, tales como las causadas por los virus.   Empleo de pruebas.

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1 DIAGNOSTICO SEROLOGICO Ag- Ac.

2   Empleo de la serología para el diagnostico de enfermedades, tales como las causadas por los virus.   Empleo de pruebas serológicas   En base a las reacciones antígeno (Ag) – anticuerpo (Ac)

3  Las reacciones Ag-Ac presentan dos estadios:  1.- Reconocimiento y unión Ag-Ac (la reacción primaria).  2.- Interacción Ag-Ac tras la formación del inmunocomplejo (reacción secundaria).

4 CARACTERISTICAS DE LA INTERACCION Ag-Ac.  ESPECIFICA  REVERSIBLE  DEPENDIENTE DEL pH  SENSIBLE A LA TEMPERATURA  SENSIBLE A LA FUERZA IONICA.

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6  DEFINICION  Es un acúmulo de reacción Ag-Ac  In vitro  Resultado de la agregación de m’os o células  Rx. Visible AGLUTINACION

7  Condiciones óptimas  1. Presencia de electrolitos  2. pH  Temperatura  Prozona. AGLUTINACION ANTIGENO (Ag) ANTIGENO (Ag)  Forme, particulado  Ejm. Células, partícula de látex

8  AGLUTINACION CUALITATIVA   En lámina   Consiste en mezclar Ag y Ac y observar la aglutinación.   Si la prueba es positiva es determinante pero el resultado negativo no.   Ej Prueba de aglutinación rápida para la brucelosis, test de determinación de grupos sanguíneos, test de Coombs para la anemia hemolítica autoinmune, AGLUTINACIÓN: TIPOS

9  TEST DE AGLUTINACIÓN CUANTITATIVA:  En tubo  Para la “titulación” de un suero: se diluye el suero y se enfrenta a una cantidad fija de Ag.  TITULO DE ANTICUERPOS:  corresponde a la máxima dilución del suero en el que la aglutinación es positiva AGLUTINACIÓN: TIPOS

10  DIRECTA  Ag forma parte de la célula (GR, bacteria)  EJM.  Dx de tifoidea, brucelosis  Determinación de serotipos o variedades bacterianos  Determinación de grupos sanguíneos.  INDIRECTA O PASIVA A ) A. pasiva o indirecta  Ag es soluble  Ag se adsorbe a partículas inertes (látex, bentonita) o a células (GR).  Se busca Ac.  A.pasiva reversa  Ac. Se adsorbe a látex  Se busca Ag.

11   Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas de látex.   Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente.   Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas.   El test de aglutinación ha sido usado para detectar antígeno de Rotavirus en heces mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. Además es una técnica rápida y barata.   También se la ha usado para detectar antígenos de Adenovirus.

12  Rx entre Ag soluble y su Ac homólogo  Se manifiesta por la formación de un pptado visible en la interfase de los reactivos  Zona de equivalencia. PRECIPITACION

13  A. Inmunoprecipitación en medio líquido: La prueba del anilloLa prueba del anillo  B. inmunoprecipitación en medio sólido: B.1. Inmunodifusión Inmunodifusión simple Inmunodifusión simple Inmunodifusión doble Inmunodifusión doble B.2. Inmunoelectroforesis B.2. Inmunoelectroforesis PRECIPITACION: TIPOS

14  Prueba del anillo:  Solución del Ag se coloca en un tubo con solución de suero (Ac)  Ambos difunden hasta alcanzar las concentraciones óptimas. INMUNODIFUSION EN MEDIO LIQUIDO

15  Utiliza un soporte de agar noble  Difunden el Ag y Ac.  Inmunodifusion simple :  Oudin  Se establece un gradiente de concentración sólo para uno de los reactivos  Sólo uno de ellos difunde INMUNODIFUSION EN MEDIO SOLIDO

16  Inmunodifusion doble:  Ouchterlony  Ag y Ac difunden  Las bandas o líneas de precipitación aparecen entre los dos pocillos. INMUNODIFUSION EN MEDIO SOLIDO

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18  Se utiliza para el análisis cualitativo de mezclas de Ag. Inmunoelectroforesis

19 FIJACION DEL COMPLEMENTO -Se produce en dos fases: 1. Rx Ag – AC 2. Se añaden GR + AC 1.2.

20  PRINCIPIO :  Utilización de un Ac. o Ag marcado con una enzima para detectar una reacción antígeno – anticuerpo  La enzima actúa sobre un sustrato generando un producto coloreado medible.  Enz: Peroxidasa, fosfatasa ENSAYOS D EINMUNOADSORCION ENZIMATICA : ELISA

21 ELISA: Fases

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23  PROCEDIMIENTOS GENERALES DE UNA TÉCNICA ELISA:  Dispensar muestras  Dispensar conjugado  Incubar a 37ºC o a temperatura ambiente  Lavar los pozos  Dispensar cromógeno/sustrato  Incubar a 37ºC o a temperatura ambiente  Dispensar solución de parada  Leer en lector de tiras ó placas de ELISA

24  ELISA DIRECTO  Detectar Ag  Utiliza anticuerpo marcado TIPOS DE ELISA

25  ELISA INDIRECTO  Para detectar Ac.  Utiliza Anti-anticuerpo marcado

26  ELISA SANDWICH  Detecta Ag o Ac. TIPOS DE ELISA

27   El MAC-ELISA (captura de anticuerpos IgM anti-dengue)   Es el sistema propuesto por la OPS, por su elevada especificidad, sensibilidad y rapidez en su ejecución.   Es una herramienta de gran valor para la vigilancia serológica de la fiebre del dengue y la FHD y es la prueba serológica seleccionada por la mayoría de los laboratorios.   Es apropiada para el análisis de sueros individuales colectados 5 o más días después del inicio de la enfermedad (MAC-ELISA).

28  ELISA COMPETITIVO  El Ac o Ag de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno.  Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra. TIPOS DE ELISA

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30 Placa ELISA. Cuanto más intensa sea la reacción de color tanto mayor será el nivel de anticuerpo IgM anti-dengue en la muestra

31  PRINCIPIO:  Emplea Ac. Conjugados a colorantes fluorescentes (fluorocromo)  Detecta Ag. o Ac.  Isotiocianato de fluoresceína, rodamina B de lisamina o ácido 1-dimetilaminonaftalen-5- sulfónico  Utiliza microscopio de fluorescencia INMUNOFLUORESCENCIA

32 TIPOS DE INMUNOFLUORESCENCIA  DIRECTA (IFD)  Detecta Ag.  Utiliza Ac. marcado  Virus respiratorio sincitial

33  INDIRECTA (IFI)  Detecta Ac.  Utiliza Anti-Ac. marcado TIPOS DE INMUNOFLUORESCENCIA

34 Los resultados para la muestra de sangre de este paciente son positivos: las células fluorescentes que aparecen aquí están infectadas con el virus del dengue

35   Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar.   Luego se agregan anticuerpos específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células.   La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.   Esta técnica se puede utilizar para una identificación rápida del virus directamente sobre la muestra   por ejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofaríngeo, o se la puede emplear para la confirmación del efecto citopático observado en cultivos celulares.

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37  RADIOINMUNOENSAYO

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39   Fue originalmente aplicado para identificar el antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo anti-HBsAg.   Estos ensayos tienen una buena sensibilidad y especificidad   pero la aparición de un método como el ensayo inmunoenzimático (EIA) con su mayor tiempo de conservación de los reactivos, su costo relativamente más bajo y la ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las técnicas de RIA en la mayor parte de los casos de detección de antígeno viral.

40 INMUNOCROMATOGRAFIA

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42 WESTERNBLOT

43 WESTERNBLOT para VIH

44 Interpretando el Examen “Western Blot” El examen detecta las proteínas del HIV (p y gp, como lo indica las franjas oscuras). En esta caso, los exámenes I y II son positivos. El III es negativo

45 Criterios para Western blot positivos para anticuerpos contra el virus de la inmunodeficiencia humana. ORGANIZACIÓN CRITERIOS Association of State and Territorial Public Halth Laboratory Directors/CDC Prueba Du Pont aprobada por la FDA Cruz Roja Americana CONSORTIUM FOR Retrovirus Serology Standarization Dos cualquiera de ; P24, gp41, gp120/gp160 P24 y p31 y gp41 o gp120/gp160 ≥Bandas: 1 de cada grupo de productos genéticos: GAG y POL y ENV. ≥ 2 bandas: p24 o p31 más gp41 o gp120/gp160