CARACTERIZACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Caracterización de los ácidos nucleicos RFLP Secuenciación Caracterización de los ácidos nucleicos EMSA Footprinting Fingerprinting SSCP

Electromobility Shift Assay (EMSA) Determina eventuales cambios en la movilidad electroforética del ADN como consecuencia de su interacción con proteínas celulares. SIRVE PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE UN PROMOTOR EN UN FRAGMENTO DE ADN

Footprinting Sirve para documentar en que región del fragmento de ADN se produce la interacción con la proteína.

Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) La ganancia, pérdida o sustitución de bases nucleotídicas pueden ser visualizadas como diferencias en la migración electroforética debido a cambios en la estructura secundaria de la cadena única de ADN.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Permite diferenciar especies y caracterizar variantes genotípicas dentro de un aislamiento viral o cepas bacterianas, micóticas y parasitarias dentro de una misma especie.

RFLP ACOPLADA A LA PCR

RFLP SEGUIDA DE SOUTHERN BLOT

Secuenciación nucleotídica Método de Sanger Secuenciación automática Next Generation Sequencing

ESTA ES LA SECUENCIA DEL TEMPLADO!!!! MÉTODO DE SANGER 5’-GAACTTGCGTA-3’ 3’-CTTGAACGCAT-5’ ESTA ES LA SECUENCIA DEL TEMPLADO!!!!

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

ELECTROFEROGRAMA O CROMATOGRAMA

NEXT GENERATION SEQUENCING La principal característica de estas nuevas metodologías es la posibilidad de secuenciado masivo de forma paralela. Útil para la determinación de la secuencia de cada una de las distintas variantes genotípicas presentes en un aislamiento viral (esencial para determinación de resistencia a drogas) o para la identificación de polimorfismos asociados a la susceptibilidad de una enfermedad (alternativa al Microarray).

EL INICIO DEL NGS

SANGER vs. NGS SANGER NGS ESTRATEGIA MUESTRAS LONGITUD DE LA LECTURA REACCIONES SEPARADAS PARA LOS DISTINTOS EXONES DE UN SOLO GEN UNA REACCIÓN PARA EL ANÁLISIS SIMULTÁNEO DE VARIOS GENES MUESTRAS CLONES, AMPLICONES DE PCR LIBRERÍAS DE ADN, GENOMA COMPLETO LONGITUD DE LA LECTURA Kb Gb DATOS UNA LECTURA/UNA MUESTRA MILES O MILLONES DE LECTURAS/UNA MUESTRA RESOLUCION MUCHAS MOLÉCULAS EN LA MISMA LECTURA UNA MOLÉCULAR POR LECTURA VENTAJA ELEVADA PRECISION BUENA RELACIÓN COSTO/BENEFICIO, ANÁLISIS SIMULTÁNEO DESVENTAJA CARO Y CONSUME TIEMPO ANÁLISIS DE GRAN CANTIDAD DE DATOS