ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO 1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de efecto cigótico y materno 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón c) Peculiaridades de Arabidopsis d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de modificadores 4) Series alélicas, su importancia y obtención 5) Estudio de los genes encontrados a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas b) Cómo obtener mosaicos c) Cómo marcar los sectores mutantes d) Modificaciones del sistema de mosaicos e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO 1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de efecto cigótico y materno 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón c) Peculiaridades de Arabidopsis d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de modificadores 4) Series alélicas, su importancia y obtención 5) Estudio de los genes encontrados a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas b) Cómo obtener mosaicos c) Cómo marcar los sectores mutantes d) Modificaciones del sistema de mosaicos e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

COMPLEJIDAD DEL DESARROLLO

¿Cómo se sabe que los productos de estos genes intervienen? ¿Cómo se sabe qué genes están en la misma ruta? ¿Cómo se sabe el orden de actuación de los que están en la misma ruta?

EL VALOR DE LOS MUTANTES El gen afectado debe estar implicado en la formación de esa estructura wt Mutante A B D C Fenotipo normal C* anormal Identificar componentes de una ruta (de señalización, metabólica … El análisis de los mutantes da pistas sobre dónde actúan los genes y el orden en que intervienen en un proceso El tipo de alteraciones que se observan en los mutantes y los que no lo hacen pueden dar pistas sobre cómo se genera una estructura

EL VALOR DE LOS MUTANTES La combinación de mutantes en un mismo individuo da pistas sobre cómo interaccionan los productos de los genes afectados Posibles fenotipos de un doble mutante (a/a; b/b): -1) Muestra tanto el fenotipo A como el B Los genes a y b actúan de forma independiente (color de flores y semillas en guisantes de Mendel) -2) Fenotipo wt, o casi wt Uno de los mutantes actúa como SUPRESOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes. -3) Fenotipo más fuerte que uno de los de partida (A o B) Uno de los mutantes actúa como INTENSIFICADOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes (parálogos, rutas paralelas …) -4) Muestra el fenotipo A o el B Uno de los mutantes actúa como EPISTÁTICO sobre el otro. Los dos genes actúan en la misma ruta y pueden hacerse hipótesis sobre su orden en ella.

LA IMPORTANCIA DEL FENOTIPADO Luz azul FOTOTROPISMO Luz azul Fitocromo A (phyA) influye en el proceso ¿phyA actúa preferentemente en el núcleo o en el citoplasma? CITOPLASMA NÚCLEO phyA FHL FHY1 Sin phyA está afectado el fototropismo Sin phyA en el núcleo apenas lo está CONCLUSIÓN: phyA actúa principalmente en el citoplasma PERO …

LA IMPORTANCIA DEL FENOTIPADO Ahora notamos que phyA sí hace algo importante en el núcleo para el fototropismo: MÁS LENTO en fhy1fhl WT phyA-NLS-GFP fhy1fhl phyAfhy1fhl phyA Fenotipado más fino: seguir la velocidad del proceso phyA actuaría sin importar si está en el núcleo, o en el citoplasma CITOPLASMA NÚCLEO phyA FHL FHY1 phyA phyA-NLS En plantas SIN phyA endógeno: todo el phyA está en el núcleo

ESQUEMA DE UNA FLOR TÍPICA

LA IMPORTANCIA DE LOS MUTANTES Hay mutantes en los que está alterado el patrón floral, NO la morfología de sus partes. En esos mutantes no hay cualquier tipo de alteración. Ver qué tipos se dan y cuáles no permite comprender cómo tiene lugar el proceso.

Mutante “A” Estructura floral: carpelos, estambres, estambres, carpelos

Mutante “B” Estructura floral: sépalos, sépalos, carpelos, carpelos

Mutante “C” pétalos en vez de estambres Estructura floral: sépalos, pétalos, pétalos, nueva flor

Mutante “C” Una nueva flor en vez de carpelos Estructura floral: sépalos, pétalos, pétalos, nueva flor

sépalo pétalo estambre carpelo B B A C C A 1 2 3 4 3 2 1

ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO 1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de efecto cigótico y materno 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón c) Peculiaridades de Arabidopsis d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de modificadores 4) Series alélicas, su importancia y obtención 5) Estudio de los genes encontrados a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas b) Cómo obtener mosaicos c) Cómo marcar los sectores mutantes d) Modificaciones del sistema de mosaicos e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

GENES DE EFECTO MATERNO (+/-) (-/-) Fenotipo normal (+/-) Fenotipo determinado por el genotipo de la madre, NO por el del individuo (+/-) Fenotipo anormal

EFECTO MATERNO CLÁSICO ¿CUÁNTO DE LA MADRE? El caso de Bicoid ♂ ♀ +/- x -/- Vive ♂ ♀ -/- +/- x Mueren ♂ ♀ +/- -/- x Viven Todo el producto del gen necesario para el desarrollo viene de la madre: EFECTO MATERNO CLÁSICO

¿DÓNDE EN LA MADRE? ♂ ♀ ♂ ♀ -/- +/- +/+ x Muere -/- +/- +/+ x Viven Mosaico +/- +/+ x Muere ♂ ♀ -/- Mosaico +/- +/+ x Viven El producto del gen necesario para el desarrollo viene de las gónadas maternas

¿CUÁNTO DE LA MADRE? ♂ ♀ ♀ ♂ ♂ ♀ El caso de Engrailed (letal en homocigosis) ♂ ♀ -/- Mosaico +/- x Muere ♀ ♂ +/- x -/- Muere ♂ ♀ -/- Mosaico +/- x Vive Mismos defectos Sólo importa el genotipo del cigoto: EFECTO CIGÓTICO CLÁSICO

Se necesita un aporte materno ¿pero produce algo el embrión? ¿CUÁNTO DE LA MADRE? -/- Muere ♀ ♂ +/- Extra sex combs (esc) Se necesita un aporte materno ¿pero produce algo el embrión? ♂ ♀ +/- x +/- Vive ♀ -/- ♂ Diferente por lo que ha producido el embrión -/- ♀ -/- ♂ T2 y T3 como T1 NO TODO el producto del gen necesario para el desarrollo viene de la madre

ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO 1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de efecto cigótico y materno 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón c) Peculiaridades de Arabidopsis d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de modificadores 4) Series alélicas, su importancia y obtención 5) Estudio de los genes encontrados a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas b) Cómo obtener mosaicos c) Cómo marcar los sectores mutantes d) Modificaciones del sistema de mosaicos e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

DISEÑO GENERAL , … x Mutagénesis y obtención de mutantes INDIVIDUALES x , … Amplificación por separado de cada mutante individual Típicamente no pueden distinguirse los distintos individuos Cruces entre hermanos de cada familia , ¿Fenotipo de interés de los mutantes en homocigosis? Mantener la mutación desde los heterocigotos, ¿cómo distinguirlos? , En especies AUTOFECUNDABLES se obtienen los homocigotos sin necesidad de amplificación previa de cada mutante individual

3a) EL “SCREENING” DE HEIDELBERG (DROSOPHILA)

DROSOPHILA COMO SISTEMA Ventajas generales: Fácil y barato de mantener Tiempo de generación corto (10 dias) Produce mucha progenie

DROSOPHILA COMO SISTEMA Ventajas genéticas: Sin recombinación meiótica en machos Sólo cuatro cromosomas Cromosomas politénicos visibles al óptico Muchos caracteres externos variables (ojos, nervios en las alas, quetas…) Un gran repertorio de técnicas y trucos Genoma completamente secuenciado

EL SCREENING DE HEIDELBERG Primer intento de hacer una búsqueda global de mutantes del desarrollo. ¿No sería inmanejable el número de genes que intervienen en el proceso? ¿Servirían de algo esos mutantes, serían informativos?

EL SCREENING DE HEIDELBERG Cosas importantes a tener en cuenta: ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener todo. Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar Planificar un esquema de cruzamientos para obtener individuos con las mutaciones y poder conservarlas. Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés. Se buscaron genes cigóticos que mataran al embrión: no llegarían a salir larvas del huevo.

CICLO VITAL DE DROSOPHILA

EL SCREENING DE HEIDELBERG Cosas importantes a tener en cuenta: ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener todo. Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar Planificar un esquema de cruzamientos para obtener individuos con las mutaciones y poder conservarlas. Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés. Se buscaron genes cigóticos que mataran al embrión: no llegarían a salir larvas del huevo. Esas mutaciones deberían causar alteraciones morfológicas visibles en la cutícula

LA CUTÍCULA EMBRIONARIA

LA CUTÍCULA EMBRIONARIA

¿Cómo hacer mutagénesis? Se hace mutagénesis de un buen número de machos de modo que un cierto porcentaje de sus espermatozoides tengan mutaciones

¿Cómo hacer mutagénesis? Los machos mutagenizados se cruzan “en masa” con hembras normales x F1 Todos los descendientes son heterozigotos. Por lo general, cada uno para una mutación distinta.

¿Cómo hacer mutagénesis? Para los mutantes recesivos es preciso obtener individuos homozigotos. Pero, ¿cómo conseguirlos? x 1/4 La autofecundación “en masa” de la F1 NO generará casi nunca homozigotos para cada mutación sino dobles mutantes en heterozigosis porque típicamente de cada mutación sólo hay 1 individuo en la F1

¿Cómo hacer mutagénesis? Cruzando POR SEPARADO cada macho F1 con hembras wt se obtiene en cada cruce (botella) 1/2 de heterozigotos para cada mutación. x F2 1/2 1/2 Hemos conseguido amplificar cada mutación: ya hay varios individuos con la MISMA mutación que luego podrán cruzarse entre ellos (No haría falta si fueran hermafroditas capaces de autofecundarse)

¿Cómo hacer mutagénesis? Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga x 1/2 1/4 de los cruces Todos wt

¿Cómo hacer mutagénesis? Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga 1/2 x 1/2 1/2 de los cruces 1/2 1/2

¿Cómo hacer mutagénesis? Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga 1/2 x 1/2 1/4 de los cruces 1/4 1/2 1/4 Fenotipo visible

¿Cómo hacer mutagénesis? Resumen de los resultados de la autofecundación en botellas donde había un mutante 1/2 x 1/2 1/16 6/16 9/16 Entre los hermanos de los mutantes habrá portadores de la mutación, pero también muchos wt

¿Cómo hacer mutagénesis? El experimento se simplificaría si hubiera algún modo de eliminar automáticamente los individuos “a” y “b” F1 x 1/2 a F2 1/2 x 9/16 b F3 1/16 6/16

¿Cómo hacer mutagénesis? Una posibilidad es usar letales recesivos (r) y letales dominantes inducibles (D) D r F1 x r r D r F2 D r

¿Cómo hacer mutagénesis? Pero si hay recombinación en la hembra el sistema puede destruirse D r D r Meiosis x r r …

¿Cómo hacer mutagénesis? Los recombinantes que se producen entre cromosomas que difieren en una inversión dan descendientes inviables. En Drosophila hay sistemas de cromosomas con inversiones, CROMOSOMAS BALANCEADORES, que pueden emplearse para evitar este problema. El “screening” se hace por separado para cada cromosoma

El “screening” de Heidelberg EMS w r B w x D w r B w D F1 Se mutagenizan con EMS varios miles de machos que después se cruzan con hembras vírgenes “en masa”

El “screening” de Heidelberg w r B r B x w D D 29º 4 dias 18º o 25º w D w r B D r B D r B F2

El “screening” de Heidelberg w r B w r B x w 1/4 r B 1/2 Mueren como larvas F3 CRITERIOS DE SELECCIÓN: -1)no hay moscas de ojos blancos; -2)de 1/4 de los huevos no salen larvas; -3)observación embriones

RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2 1500 machos mutagenizados se cruzaron con unas 2500 hembras vírgenes x D r B w EMS

RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2 1500 machos mutagenizados se cruzaron con unas 2500 hembras vírgenes 10.000 cruces individuales de F1, 5764 dieron suficiente descendencia w r B D x

RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2 w 1/4 r B 1/2 Mueren como larvas 4217 de las F2 no dieron descendientes de ojos blancos (73% → 1.3 mut/crom) Poisson, no media 2843 daban 25% huevos de los que no salían larvas

RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2 Examen a la lupa de los embriones de las 2843 líneas 1620 líneas son letales embrionarios auténticos 321 muestran defectos claros cutícula Análisis de complementación: 61 genes, 48 con más de 1 alelo, 13 con 1 alelo

ASPECTO DE ALGUNOS MUTANTES

MUCHOS MUTANTES CON PROBLEMAS EN LOS SEGMENTOS

LOS MUTANTES SUGIEREN APARICIÓN PROGRESIVA DE PATRONES Zonas a lo largo del eje A/P 14 parasegmentos Borde anterior y posterior de cada parasegmento Identidad de cada región

SATURACIÓN DEL “SCREENING” ¿Qué fracción de los genes que se podría encontrar con este protocolo de trabajo se ha encontrado realmente? ¿Merece la pena seguir buscando con este protocolo? Criterio 1: seguir la marcha del proceso Cada vez se encuentran menos GENES nuevos Constantemente aparecen mutantes, pero … El caso del cromosoma 2 de Drosophila:

SATURACIÓN DEL “SCREENING” Criterio 2: número de alelos por gen. Cuantos más haya, más cerca de la saturación. El caso del cromosoma 2 de Drosophila: Aproximadamente 4,55 alelos/locus (hay mejores aproximaciones) ¿Podemos predecir cuántos genes quedan por encontrar? Asunción clásica: la distribución de frecuencias de alelos sigue una Poisson La fracción de genes sin mutar (0 alelos) será: P(0)= e-m Caso del cromosoma 2: m=4,55, P(0)= 0,01. El 1% del total de genes que se podrían encontrar no se ha mutado aún, quedarían menos de 1 (0,6)

SATURACIÓN DEL “SCREENING” Problema: muchas veces la distribución no parece una Poisson. Previsible si no todos los genes tienen la misma probabilidad de recuperarse como mutantes. El caso del cromosoma 2 de Drosophila: Poisson para m = 4,55 alelos/locus Fuerte exceso de loci con una mutación Posteriormente se han encontrado 8 genes más en este cromosoma con el tipo de problema buscado en el “screening” original. Esos 8 loci representan el 11,6% del total de 69 loci, P(0)=0,116, mucho más que lo previsible según Poisson (P(0)=0,01)

SATURACIÓN DEL “SCREENING” Criterio 3: análisis de deleciones. ¿Las hay que causen un fenotipo de interés pero en las que no mapee uno de los loci identificados? El caso del cromosoma 2 de Drosophila: Crom. 2 Deleciones (cubren 30% del cromosoma) Deleciones dando fenotipos cuticulares Loci de mutantes previamente identificados En todas mapea alguno de los loci identificados (compatible con saturación)

3b) PROBLEMAS EN OTROS ORGANISMOS: PEZ CEBRA Y RATÓN

EL PEZ CEBRA COMO SISTEMA MODELO DE VERTEBRADOS Pequeño tamaño (3-4 cm) Tiempo de generación corto (3-4 meses) Alta fecundidad (100-200 huevos/hembra) Fácil de mutagenizar Embrión transparente y de desarrollo externo Se puede fecundar “in vitro”. Esperma congelable

“SCREENINGS” EN EL PEZ CEBRA Amplificación de cada mutante en una familia F2 1/4 de los cruzamientos entre los F2 darán individuos homozigotos para m: con fenotipo visible Varias peceras, cada una con cruces entre parejas de hermanos F2

“SCREENINGS” DEL PEZ CEBRA “SCREENING” DE TÜBINGEN 49 MACHOS MUTAGENIZADOS 3075 FAMILIAS F2 INICIADAS 2746 FAMILIAS F2 ANALIZADAS (14.357 cruces para dar F3) 4624 MUTANTES OBTENIDOS 1163 MUTANTES CONFIRMADOS 372 GENES IDENTIFICADOS 150 GENES CON MÁS DE 1 ALELO 222 GENES CON 1 ALELO Nº alelos/gen: de 1 a 34. Nº medio: 2.4 Development 123:1-36 (1996) “SCREENING” DE BOSTON 266 MACHOS MUTAGENIZADOS 2799 FAMILIAS F2 INICIADAS 1808 FAMILIAS F2 ANALIZADAS (más de 30.000 cruces para dar F3) 2383 MUTANTES OBTENIDOS 695 MUTANTES CONFIRMADOS 220 GENES IDENTIFICADOS 56 GENES CON MÁS DE 1 ALELO 164 GENES CON 1 ALELO Nº alelos/gen: de 1 a 11. Nº medio: 1.5 Development 123:37-46 (1996)

“SCREENING” DE HAPLOIDES Ventaja: Enseguida se detectan mutaciones interesantes Problemas: -1)Los embriones haploides acaban muriendo -2)Los embriones haploides tienen algunos problemas de desarrollo

MÉTODOS ALTERNATIVOS Presión poco después de la fertilización: NO se completa la meiosis II y embriones diploides Problema: no son completamente homocigotos Choque térmico tras fertilización: NO se completa 1ª mitosis tras meiosis y embriones diploides y completamente homocigotos Problema: pobre viabilidad (10-20%) “Screeining” de haploides ya visto

EL RATÓN COMO MODELO Es un mamífero (cercano al hombre) Genoma secuenciado Transformable y sistemas “knock out” Corto tiempo de generación (2 meses) Desarrollo embrionario intrauterino Requerimientos de espacio en jaulas Pocos programas de mutagénesis a gran escala: unos 300 mutantes dominantes (visibles en G1) desde más de 40.000 ratones, pocos de desarrollo

DISEÑO DE UN CROMOSOMA BALANCEADOR EN RATÓN Sin Wnt3 el ratón muere Ag da color amarillento al pelo Puro y Neo dan resistencia a antibióticos Se obtiene un gen Hprt funcional, Hprt permite crecer en medio HAT ca. 1/3 del cromosoma con la inversión

UN BALANCEADOR PARA EL CROMOSOMA 11 Color amarillento de partes del cuerpo de los ratones portadores de la inversión

ESQUEMA DEL “SCREENING” Ratones macho Marcador dominante REX: pelo rizado Mutación Camadas de más de 24 ratones sin animales negros indican un mutante recesivo letal

3c) PECULIARIDADES DE ARABIDOPSIS

MUTAGÉNESIS EN ARABIDOPSIS Meristemo apical del embrión Nº células del meristemo que contribuirán a las semillas de la planta = 2 en Arabidopsis Sector m/+ +/+ Como cada individuo se autofecunda no hace falta una generación previa de amplificación del número de individuos m/+