Jacob Gómez Romero Sede Regional Centro Octubre, 2015 Análisis de pirosecuanciación de un consorcio bacteriano para el diseño de un proceso de producción de biohidrógeno en continuo por co-digestión anaerobia Jacob Gómez Romero Sede Regional Centro Octubre, 2015

Contenido Introducción Por que biohidrógeno? Digestión anaerobia Co-digestion anaerobia Sistema CSTR Objetivos Metodología Resultados Análisis de pirosecuenciación Co-digestion en continuo Conclusiones

Por que biohidrógeno? Amplia variedad de m.o. lo producen bajo condiciones anaerobias Biohidrógeno puede ser producido de residuos orgánicos de bajo costo “Biomasa”. La producción de biohidrógeno por vía fermentativa tiene un gran potencial a escala industrial (Kapdan et al., 2006; Rocha et al., 2011)

Digestión anaerobia Polímeros Monómeros y oligomeros Intermediario Proteínas, polisacáridos, lípidos Monómeros y oligomeros Aminoácidos, azúcares, ác grasos Intermediario Propionato, Butirato, alcoholes Acetogénesis Metanogénesis CH4 + CO2 H2 + CO2 Acetato (Kapdan et al., 2006; Rocha et al., 2011)

Co-digestión anaerobia “Diferentes residuos son mezclados y tratados” Ventajas Mejora rendimientos- Biogás, H2 Capacidad buffer-Intrínseca Efecto sinérgico- alta conversión, Dilución de compuestos tóxicos (amonio, ác. grasos) Incremento de biodegradabilidad Ajuste- Balance de nutrientes (ratio C/N) (Khalid et al., 2011; Gómez-Romero et al., 2014b)

Continuous Stirrer Tank Reactor Sistema en continuo Tiempo de residencia hidráulico (TRH) velocidad de carga orgánica (VCO) Estabilidad TRH TRH Critico < 0.5h Dinámica poblaciones m.o H2/CH4 Lavado de biomasa VVPH2, RH2, %R/Disminución VCO crit(Overload)>154 g L-1d-1 VVPH2 ,incremento VVPH2 , RH2, %R, Disminución HPr, incremento VCO Continuous Stirrer Tank Reactor (CSTR)

Importancia del estudio de comunidades bacterianas Factores Medio ambientales (pH, temperatura, presión parcial de H2, etc.) Pre-tratamientos de inóculo Condiciones de operación (TRH, VCO) Co-sustratos (Yang et al., 2007; Kim et al., 2006). “Entender y dilucidar los mecanismos de las bacterias puede permitir incrementar la producción de biohidrógeno” Comunidades bacterianas Sustratos Ahora bien, es importante conocer las comunidades bacterianas implicadas o involucradas en la producción bioH2, para controlar y maximizar los rendimientos de BioH2. Sin embargo, estas comunidades bacterianas pueden ser modificadas por varios factores. Estos factores pueden ser: medioambientales, por pre-tratamientos inducidos, sustratos utilizados y condiciones operacionales de los sistemas. Recientes estudios en procesos de co-digestión, mostraron que la adición de pequeñas cantidades de sustratos modifican estas comunidades bacterianas en los sistemas. Por lo tanto, investigación básica es necesaria para determinar los efectos de co-sustratos en los procesos de co-digestión para entender mejor y dilucidar los mecanismos e incrementar la producción de BioH2. Clostridium tyrobutiricum Lactobacillus ( Wang et al. 2013) Klebsiella

Objetivo Desarrollar un sistema de producción de biohidrógeno en continuo a partir de un análisis de pirosecuanciación de la estructura de la cumunidad bacteriana, utilizando lactosuero y residuos sólidos orgánicos. Asimismo, evaluar diferentes tiempos de retención hidraulico (TRH) y velocidades de carga orgánica (VCO) sobre la velocidad volumétrica de producción de hidrógeno y rendimiento en el sistema en continuo.

Metodología

Análisis de pirosecuenciación Extraction DNA Inóculo adaptado CTAB-Protocolo DNA purificado Lactosa, 30 g/L Protocolos Titanium (Lubbock, TX, USA) 454-Pirosecuenciación Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing FLX-Titanium System Genome Sequencer Research and Testing Laboratory (Lubbock, TX, USA)

Sistema dedesplazamiento Puerto de maestro de gas Tanque de efluentes Tanque de alimentación Bioreactor 35°C pH, 5.5 Sistema dedesplazamiento Salida de biogas Puerto de maestro de gas Puerto de muestreo líquido Sistema de co-digestion continuo Fase lote 1 2 3 4 5 6 7 8 TRH (h) 60 48 38 28 18.7 15 10 17 VCO (g DQO -1L*-1d) 21.9 29.2 41.1 54.0 76.4 97.6 155.8 80.2 Análisis de muestras Sistema Hach Cromatografía de gases TCD Silica %H2 %CH4 Carbohidratos totales Proteína -biomasa Demanda química de oxígeno (DQO)

Resultados

Dos-etapas en co-digestion lote… porque? Hidrogenica Bacterias productoras de H2 ? Microorganismos by hydrogen producing bacteria. Hidrolítica Bacterias No productoras de H2

Análisis de pirosecuenciación: estructura bacteriana Resultados Co-digestión: lote Bifidobacterium sp. inicialmente hidroliza el almidón en pequeñas moléculas que después son metabolizados por especies de Clostridium durante la producción de biohidrógeno (Cheng et al., 2008). Fig. 1. Inóculo adaptado a lactosa (comienzo del proceso de co-digestión). Gomez-Romero, J., Gonzalez-Garcia, A., Chairez, I., Torres, L. García-Peña. (2014). Selective adaptation of an anaerobic microbial community: Biohydrogen production by co-digestion of cheese whey and vegetables fruit wastes. Int. J. Hydrogen Energy. 39; 12541-50.

Sistema continuo: Fase hidrolítica Cuadro 1. Resumen de resultados promedio iniciales y finales de carbohidratos totales, lactato, acetato, producción de biogás y composición (CH4 y H2). Parámetro Valores promedio Inicio Final Carbohidratos totales (g/L) 30.44 ±5.6 0.03±0.06 Lactato (g/L 0.14±0.02 3.15±0.31 Acetato (g/L) ND 2.89±0.34 Amonio (mg/L) 184.40±18.5 239.58±35.75 Biogás (mL) 2,965.91±517 Metano (%,v/v) ND* Hidrógeno (%, v/v) 99.34% Inhibición por amonio 0.8 g/L Salermo et al., (2008)

Sistema continuo: fase hidrogénica Cuadro 2. Condiciones de tiempo de residencia hidráulico (TRH) y velocidad de carga orgánica (VCO) en el sistema en continuo. Tratamiento TRH (h) VCO (g L-1 d-1) 1 60 21.91 2 48 29.26 3 38 41.19 4 28 54.01 5 18.7 76.41 6 15 97.67 7 10 155.87 8 17.5 80.20

Efecto del TRH, VCO sobre VVPH2 y % bioH2 Resultados Co-digestión: Continuo 8.6 7.7 Valor promedio más alto VVPH2 Valores promedio VVPH2 5.9 5.6 3.8 3.5 2.8 2.1 17.5 TRH de 28 a 15 h De 50 a 60% En esta grafica podemos observar el efecto del TRH y VCO sobre VVPH2 y contenido de BioH2. El sistema de co-digestion en continuo fue iniciada con un sistema en lote y después 155 h, se paso a modo continuo. Durante el sistema lote se alcanzó una VVPH2 de 5.75 mmol H2/L h. Después se fue reduciendo gradualmente el TRH de 60 a 10, con correspondiente incremento de la VCO de 21, 960 a 76,400 mg COD / L d. Bajo un THR de 60 h (VCO, 21,960 mg COD / L d), la VVPH2 promedio fue 2.1 mmol H2 / L h. en cuanto al promedio de los TRH de 48, 38, 28 h 18.7 h (VCO, 29,200, 41,100, 54,000 76,400 mg COD / L d) estos fueron de 2.8, 3.5, 3.8 and 5.6 mmol H2/L h, respectivamente. Podemos observar que de un TRH de 60 a 18.7 h, la VVPH2 fue incrementada linealmente. En tanto que de 18.7 a 10 h, la VVPH2 mostro un comportamiento casi exponencial en el crecimiento. En general, un incremento de la VVPH2 fue obtenido de 2.1 a 7.7 mmol H2/L h cuando el TRH fue decrecido de 60 a10 h) y VCO fue incrementada de 21,900 a 155.800 mg COD/L d). Sin embargo, una alta inestabilidad de VVPH2 fue observada, bajo un TRH de 15 and 10. Esta inestabilidad puede ser debida a o causada por un posible lavado de la biomasa productora de BioH2 o por ulna sobrecarga del sistema. Con la finalidad de evaluar la recuperavilidad y robustez del sistema, un incremento del TRH a 17.5 h fue evaluado, con correspondiente VCO de 80,200 mg COD/L d. Bajo esta condición, el valor promedio más alto de VVPH2 fue alcanzado (8.6 mmol H2/L h). Por lo tanto, las condiciones de TRH y VCO optimas fueron, 17.5h y 80,200 mg COD/L d, respectivamente. Ahora en cuanto la concentración de BioH2 en el biogás se mantuvo entre 50 y 60%, con un promedio en general de 53%. Sin embargo, se presento una tendencia a la baja entre 28 y 15 h. Ahora bien, cuando las condiciones TRH fueron de 15 y 10 h hubo una caída por abajo de 50%. Posiblemente la caída de la concentración de BioH2 se debió al lavado de biomasa productora de BioH2. Es importante señalar que bajo todas las condiciones evaluadas No hubo producción de metano CH4, esto sustenta que el sistema fue capaz de mantenerse estable y selectivo en cuanto a los microorganismos productores de BioH2. TRH, 15 y 10 h  50% Gómez-Romero, J; Gonzalez-Garcia, A.; Chairez, I; Torres, L; García-Peña, E.I. 2015. Two-phase co-digestion process for bio-hydrogen production continuous from agro-industrial wastes. Submmitted to International Journal of Hydrogen Energy

Efecto del TRH y VCO sobre rendimiento BioH2 Sobrecarga: inhibición por sustrato a altas VCO. Altas VCOs disminuyen RH2 (Van Ginkel y Logan, 2005) Resultados Co-digestión: Continuo Máximo rendimiento de BioH2: 800 mL H2/g DQO VCO, 80 g L-1 d-1 Lavado de bacterias productoras de BioH2 a muy cortos TRH (Santos et al.,, 2014a) Ahora, como influye el TRH y VCO sobre el RH2?. Se ha evidenciado que la VCO y TRH impactan determinante en el rendimiento del BioH2. En este grafico podemos observar que con forme se incrementa la VCO se incrementa rendimiento BioH2 hasta un máx. de 800 ml H2/g DQO, encontrándose una VCO óptima de 80 gDQO/L*d. No obstante, por arriba de este valor de VCO el rendimiento cae abruptamente. Este comportamiento, con cuerda con estudios previos por Van Ginkel y Logan 2005. Un comportamiento similar se encuentra con el TRH, donde el optimo encontrado fue de 17.5 h. Co-digestión de residuos de comida con aguas residuales de cocina: 490 mL H2 gDQO-1 a VCO de 24 g DQO L-1d-1 y TRH de 38 h (Tawfik et al., 2012) TRH, 17 h Gómez-Romero, J; Gonzalez-Garcia, A.; Chairez, I; Torres, L; García-Peña, E.I. 2015. Two-phase co-digestion process for bio-hydrogen production continuous from agro-industrial wastes. Submmitted to International Journal of Hydrogen Energy

Conclusiones Los resultados mostraron la importancia y la utilidad del conocimiento sobre la estructura de la comunidad microbiana para la planeación de un proceso continuo biohidrógeno . Este conocimiento ayudado a desarrollar un proceso de producción biohidrógeno más eficiente y estable en dos etapas . En la etapa de hidrólisis se hidroliza los carbohidratos complejos a sustratos solubles y más simples, lo cual permitió un mejor desempeño durante la etapa hidrogénesis . En la etapa hidrogénesis fueron obtenidos valores máximo de rendimiento biohidrógeno y VVPH2 de 800 ml de H2/g DQO y 8,6 mmol H2/L h bajo parámetros óptimos de la TRH y OLR de 17,5 h y 80.200 gDQO ​​/ L, respectivamente.

Muchas gracias por su atención Bi Contacto: Jacob Gómez Romero, PhD Elvia Inés García Peña, PhD Departamento de bioprocesos. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología-IPN, México, 07340. E-mail: bocaj23@hotmail.com