Aislamiento de cromosomas del lenguado senegalés (Solea senegalensis, Kaup 1858) mediante técnicas de microdisección láser. Autor: Sergio Linares fernández Universidad de cadiz Grado en biotecnología Facultad de ciencias Laboratorio de genética Laureana rebordinos gonzález Manuel alejando merlo torres Curso:2014/2015 Tutores

Introducción: Lenguado Senegalés Nombre científico: Solea Senegalensis Interés en el mercado europeo y creciente producción. Alto valor 12-15€/kg Desarrollo de la acuicultura No se han implementado grandes programas de mejora genética. Interés en investigación para desarrollarlos: Interés en las bases genéticas del lenguado PCR NGS Técnicas de citogenética tradicionales y moleculares Microdisección láser DOP-PCR Vega y colaboradores 2002 A) B)

Objetivos Principal Optimización de la condiciones para la microdisección láser y amplificación de los cromosomas aislados. Objetivos parciales: a) Obtener las mejores extensiones cromosómicas posibles en portaobjetos PET, para facilitar el aislamiento posterior de los cromosomas. b) Lograr las mejores condiciones de corte y catapultado, para obtener el corte más fino, menos energético y efectivo ajustando las condiciones del láser y la metodología del proceso. c) Conseguir la cantidad mínima de cromosomas y condiciones óptimas para el desarrollo de la DOP-PCR.

Metodología del trabajo Se mejoró la extensión de los cromosomas en las preparaciones Se ajustó las condiciones y parámetros del láser Se puso a punto la DOP-PCR

Extensión preparaciones cromosómicas. Se busca obtener la mejor extensión que permita un óptimo aislado. Preparaciones de buena calidad Buena extensión Portaobjetos normales Se usaron tres protocolos distintos Portaobjetos PET Se hicieron variaciones de temperatura en el protocolo anteriormente elegido

Portaobjetos convencionales Pretratamiento Portaobjetos Muestras

PORTAOBJETOS CONVENCIONALES Tratamiento Homogenizado con Ácido Acético 45% Los portaobjetos en una placa calefactora a 45ºC Se realizó el splash Fijación a 45ºC. Retirar ácido acético cada 15-20 Calor Los portaobjetos se someten a frío seco -20ºC. Homogenizado en Carnoy. Se realiza Splash Se dejan a 37ºC en la placa calefactora húmeda. Se gota Carnoy Fijación durante 1 hora a 37ºC Zeiss Los portaobjetos se someten a frío húmedo -20ºC. Homogenizado en Carnoy. Se realiza Splash Se dejan a 50ºC en la placa calefactora húmeda. Se gotea Carnoy Se fija durante 10 min Jena

PORTAOBJETOS CONVENCIONALES 1 min EtOH 30% 1 min EtOH 50% 5 min EtOH 70% 5 min EtOH 90% 5 min EtOH 100% 10 min EtOH 100% (Temperatura ambiente) 1) Deshidratación Post-tratamiento Medida del área en píxeles de las placas metafásicas con ImageJ. Análisis de Datos. Una hora en la estufa a 72ºC 2) Envejecimiento Teñir durante 15 min, con Giemsa 8% en tampón fosfato. Lavar con agua destilada 3) Tinción Giemsa

Resultados Portaobjetos convencionales Jena Resultados Portaobjetos convencionales 4x 10x 40x Calor Zeiss Jena

Después de teñir se mantuvo 15 min a 50ºC Material y métodos PORTAOBJETOS PET Post-tratamiento Pretratamiento Tratamiento Jena 50ºC 60ºC 65ºc Post-tratamiento Después de teñir se mantuvo 15 min a 50ºC Henegariu y colaboradores

60ºC resultados 50ºC 60ºC 65ºC

Ajuste microdisector Parámetros Energía Enfoque Ciclos Velocidad Necesidad de Optimizar el corte por diversos problemas. Cromosomas de lenguado muy pequeños. Daños al realizar los cortes y dificultad de aislamiento. El láser se desenfocaba. Cortes irregulares dependiendo de la localización en la membrana. Necesidad de ajustar parámetros y metodología mejor que a la usada anteriormente. Parámetros Energía Enfoque Ciclos Velocidad

Posición Preparación Láser (-) Energía (+) Preparación No corta Desenfocado Enfoque óptimo 1º 2º 3º Enfocar Aumentar energía

Resultado corte láser Parámetro Protocolo inicial Protocolo optimizado Energía Corte (µ J) ≈37 20 incrementando hasta 37(máx.) Energía Catapultado (µ J) 10 10-20 Velocidad de corte µm/s 5 Numero de ciclos de corte 1 20,Aunque se realizar los necesarios hasta que completar el corte

Dop-PCR PCR con primers degenerados. A partir de cromosomas microdiseccionados. Se usaron dos protocolos con distintas polimerasas Termolábil (Secuenasa) Termoestable ( Roche) Se mantuvo la esterilidad para evitar contaminaciones Puntas con filtro Tratamiento UV Cabina de flujo Cuidado en el manejo de reactivos

Dop-pcr Primers DOP ADN molde ADN molde Smear 200pb 800pb Degenerados (5′-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3′) Unión inespecífica 1ª PCR) ADN molde 2ª PCR) Tamaños de fragmentos aleatorios Fragmentos de diferentes tamaños Smear 200pb 800pb

Polimerasa Secuenasa (Termolábil) Programa ciclos a baja temperatura. Paso Temperatura Tiempo (min) Observaciones 1 92ºC 5:00   2 25ºC 2:00 Adicionar 0.24 µL de Secuenasa 3 34ºC 4 90ºC 1:00 5 Ir a 2, repetir 6 veces 6 30ºC 2:20 Programa ciclos a alta temperatura. 7 94ºC Calentamiento inicial para Platinium polymerase 8 9 56ºC 10 70ºC 11 Ir a 8, repetir 31 veces 12 10:00 13 4ºC ∞ 14 Final

Polimerasa Roche (Termoestable) Paso Temperatura Tiempo en minutos 1 94ºC 9:00 2 1:00 3 30ºC 2:30 4 72ºC 3:00 5 Ir de 2 a 4, repetir 9 veces 6 7 62ºC 1:30 8 9 Ir de 6 a 8, repetir 30 veces 10 70ºC 8:00 11 4ºC ∞ 12 Final

Resultados DOP

Resultados DOP

Optimización del Tiempo: Diagrama de Gantt 22%

Conclusiones 1. Se consiguió optimizar el proceso completo y las condiciones de microdisección láser y amplificación mediante DOP-PCR. 2. Se mejoraron las preparaciones cromosómicas, y se confirmó que el mejor protocolo fue el de Jena. Asimismo un incremento de la temperatura de la placa calefactora en el protocolo de Jena hasta los 60ºC, en comparación a los 50ºC iniciales, favoreció la extensión de los cromosomas en los portaobjetos PET. 3. Se perfeccionó significativamente el aislamiento cromosómico por microdisección láser. El nuevo método implementado, con el que se inicia el corte con una energía de láser mínima de 20 μJ, para enfocar el láser y posteriormente aumentar la energía progresivamente hasta cortar la muestra consiguió ser útil para minimizar los daños a los cromosomas.

Conclusiones 4. Se constató que el uso de la polimerasa termoestable de roche era válida para la realización de la DOP-PCR. El uso de una polimerasa termoestable facilitó la DOP-PCR con respecto al uso de la polimerasa termolábil (Secuenasa). Se simplificó la preparación de reactivos, necesitando una sola mezcla de reacción, en vez de dos. Además no hay que añadir polimerasa en cada ciclo de desnaturalización en la etapa de amplificación a baja temperatura, como sucedía con la Secuenasa. Traduciéndose estos cambios en un menor trabajo de laboratorio y una mayor dificultad de contaminación de las muestras, ya que estas se manipulan menos. 5. Se obtuvo que la cantidad mínima de cromosomas microdiseccionados en Solea senegalensis que generaban productos en la DOP-PCR está cercana a los 7 cromosomas.

Perspectivas Futuras Permitirá aislar cromosomas y brazos cromosómicos específicos mediante microdisección láser. Las muestras aisladas serán amplificadas por DOP- PCR, que serán de utilidad para: Secuenciación. Generar sondas para el pintado cromosómico. Con ello se podrá continuar y completar los estudios en Solea senegalensis. FUTURO TFG

Muchísimas gracias por su tiempo y atención Muchísimas gracias por su tiempo y atención. Y especialmente al laboratorio de genética, a mi familia y amigos.