Marcadores de ADN

¿Por qué usar marcadores de ADN en estudios de diversidad biológica?

Dependiendo de las condiciones ambientales, un mismo genotipo puede expresarse como distintos fenotipos Genotipo 1 ambiente Fenotipo 1 Fenotipo 2 Fenotipo 3

FENOTIPO GENOTIPO

¿Cómo surgen las variantes genéticas (genotipos) en la naturaleza? Mutaciones Reordenamientos cromosómicos

Las mutaciones que no son reparadas son incorporadas a la población Polimorfismo genético: presencia de múltiples formas alélicas para un mismo locus

¿Por qué se mantiene el polimorfismo genético en la naturaleza si la selección natural actúa seleccionando a los alelos mejor adaptados? ?

El caso de la anemia falciforme Eritrocitos normales Eritrocitos en anemia falciforme Plasmodium Anopheles

Análisis cuali y cuantitativo de la diversidad biológica Ecología Evolución Sistemática Agronomía Silvicultura Biotecnología

Algunas aplicaciones de los marcadores de ADN En ciencia aplicada Mapeo y ligamiento a atributos de interés agrícola y forestal (MAS: Markers Assisted Selection) Detección de genotipos “exóticos” como fuente de genes de atributos de interés biotecnológico En ciencia básica Indicadores de diversidad genética para la aplicación de programas de manejo y conservación de recursos genéticos Estudios de sistemática (taxonomía y filogenia)

Las técnicas de biología molecular ofrecen una gran variedad de herramientas para realizar estudios de diversidad genética de alta resolución Marcadores genéticos

Conclusiones que se pueden obtener del análisis con marcadores de ADN genético multi-locus (ejemplo RFLP con sonda microsatélite) Ejemplo de análisis: F y H: Siempre heredados juntos - ligados? A y B: En la progenie siempre A o B - alélicos? A y D: 4 combinaciones: A y D, A, D o ninguno - no ligados? Alelo P posiblemente ligado a I y C

ADN eucariótico Genes funcionales de copia única ADN repetido ADN espaciador Secuencias funcionales Secuencias sin función conocida Familias de genes funcionales (y pseudogenes relacionados) Secuencias funcionales no-codificantes Repeticiones de heterocromatina centromérica Repeticiones en tandem de número variable Transposones Familias de genes dispersos Familias de genes en tandem

Características deseables en un marcador de ADN: Comportamiento altamente polimórfico. Herencia codominante. Presencia frecuente en el genoma. Distribución regular en el genoma. Comportamiento selectivamente neutro. Altamente reproducibles. Fácil acceso.

Genotipo 1,1 1,2 2,2 Marcador codominante (Ej. RFLP, VNTR) 1,1 1,2 2,2 Marcador codominante (Ej. RFLP, VNTR) Marcador dominante (Ej. RAPD, AFLP)

Clases de marcadores de ADN Técnicas de análisis multi-locus basadas en la hibridación RFLP con sondas minisatélites y microsatélites (VNTRs clásico) Técnicas de análisis multi-locus basadas en la PCR RAPD AFLP Técnicas de análisis single-locus basadas en la PCR SSR (Análisis de VNTRs) PCR-RFLP PCR-Secuenciación

Técnicas de análisis multi-locus basadas en la hibridación RFLP con sondas minisatélites y microsatélites (VNTRs)

Empleando 8 Er de 6 pb: 4096/8 = 500 pb ¿En qué se basa el análisis de Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP)? Una Er cuya secuencia de reconocimiento es de 6pb es probable que encuentre su secuencia una vez cada 4096 pb (46 ) en un genoma Se puede detectar la presencia de polimorfismo genético en una de cada 500 pb Empleando 8 Er de 6 pb: 4096/8 = 500 pb Se puede detectar la presencia de polimorfismo genético en una de cada 32 pb Empleando 8 Er de 4 pb: 256/8 = 32 pb Una Er cuya secuencia de reconocimiento es de 4pb es probable que encuentre su secuencia una vez cada 256 pb (44 ) en un genoma

¿Cómo se detecta el polimorfismo? Sondas: Minisatélites: repeticiones de 10 a 35 pb Microsatélites: repeticiones de 2 a 10 pb

mediante VNTRs (clásico) Análisis de paternidad basado en el análisis de VNTRs (clásico) Análisis forense mediante VNTRs (clásico)

Técnicas de análisis multi-locus basadas en la PCR RAPD AFLP

ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) ADN molde, partidor, dNTPs, Taq pol Denaturación Unión del partidor Extensión Separación electroforética de los productos amplificados

CONC-001: ranuras 2 y 9 CONC-006: ranuras 3 y 10 CONC-007: ranuras 4 y 11 México: ranuras 5 y 12 China: ranuras 6 y 13 Australia: ranuras 7 y 14 D. bardawil: ranuras 8 y 15 P-100 OPA-11 Patrones de amplificación RAPD de 7 cepas de D. salina analizadas, con los partidores de RAPD P-100 (ranuras 2 a 8) y OPA-11 (ranuras 9-15)

Análisis de datos nab S = na+nb I II III IV Similitud Análisis de agrupamiento UPGMA derivado de la data de RAPD Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4 Cepa 5 Cepa 6 Cepa 7 I II III IV 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Similitud Análisis de datos nab S = na+nb nab: nº bandas compartidas na: nº bandas en a nb: nº bandas en b

AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism)

Técnicas de análisis single-locus basadas en la PCR SSR (Análisis de VNTRs) PCR-RFLP PCR-Secuenciación

Los marcadores SSR (Simple sequence repeat) o microsatélites, presentan la ventaja de que las regiones que flanquean las repeticiones son, generalmente, conservadas entre genotipos de la misma especie Diseño de partidores

Heterocigoto Homocigoto Las diferencias detectadas están dadas por cambios en el número de repeticiones de las secuencias microsatélites (flanqueadas por los partidores) en los distintos alelos

Actualmente la determinación de paternidad se hace analizando SSRs utilizando partidores específicos Madre Hijo Padre?

Análisis single locus por RFLP o secuenciación

Distribución de las secuencias ribosomales en el ADN nuclear eucarionte IGS IGS Forward ITS-1 ITS-2 18S 5.8S 28S Reverse Región ITS

Fragmento ITS sin digerir Taq I AluI Análisis de PCR-RFLP en cepas de Haematococcus pluvialis

Las diferencias en la secuencia son más específicamente reveladas por secuenciación

Secuenciación de la región ITS en cepas de Dunaliella salina

Tamaño del fragmento ITS en cepas de Dunaliella salina 1.- CONC-001 2.- CONC-006 3.- CONC-007 4.- México 1500 700 500 M 1 2 3 4 5 6 7 pb 5.- China 6.- Australia 7.- D. bardawil Cepa ITS-1 (pb) ITS-2 (pb) CONC-001 213 232 CONC-006 214 225 CONC-007 214 231 México 214 225 China 213 226 Australia 213 226 D. bardawil 213 227 Longitud de los espaciadores ITS-1 e ITS-2

Matriz de divergencia de las secuencias ITS-1 e ITS-2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. CONC-001 2. CONC-006 3. CONC-007 4. México 5. China 6. Australia 7. D. bardawil 8. D. viridis 9. D. tertiolecta - 0.1019 0.0275 0.0989 0.1014 0.0906 0.1014 0.1416 0.1085 - 0.1145 0.0778 0.0829 0.0751 0.0880 0.1519 0.1244 - 0.1007 0.1034 0.0980 0.1032 0.1613 0.1298 - 0.0023 0.0209 0.0092 0.1380 0.1275 - 0.0232 0.0115 0.1409 0.1304 - 0.0304 0.1291 0.1105 - 0.1407 0.1239 - 0.1164 -

A B C D Arbol de MP y ML basado en las secuencia ITS D. salina México D. salina China D. bardawil D. salina Australia D. salina CONC-006 D. salina CONC-001 D. salina CONC-007 D. viridis D. tertiolecta A B C D

Análisis de diversidad genética en comunidades

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) PCR con partidores específicos ADN Ambiental 1 ADN Ambiental 2 Concentración de denaturante Gel de agararosa de los productos de PCR

DGGE profiles of archaeal 16S rRNA gene fragments from a full-scale activated sludge plant showing changes in the archaeal communities over time.

Secuenciación ADN ambiental ...etc... Secuenciación PCR con partidores específicos ADN ambiental ...etc... Secuenciación G e n o t c a