Genética Médica – Tema 2 Estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del DNA Bibliografía: Griffits AJ et al.

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1 Genética Médica – Tema 2 Estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del DNA Bibliografía: Griffits AJ et al. (2000) pp23-28; pp Tamarin RH (1996) pp , pp Klug WS y Cummings MR (1999) pp , pp Inma Martín Burriel Genética Médica. Tema 2 Curso Estructura y organización del genoma

2 Tema 2 Estructura y organización del Genoma Polimorfismos genéticos:
Variaciones en el número de repeticiones Mutaciones puntuales Aplicaciones de los polimorfismos genéticos en Medicina

3 Estructura en doble hélice del DNA:
10pb /vuelta Destrógira Bases apiladas perpendicularmente

4 Genoma

5 Genoma

6 Genes de copia única Codifican para una única proteína
Gen eucariota Unidad de transcripción Región reguladora aguas arriba Promotor Inicio transcripción 5’UTR Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4 Fin Intrón 1 Intrón 2 Intrón 3 interna aguas abajo Codifican para una única proteína Se encuentran en una única posición del genoma (un individuo 2 copias)

7 Genoma

8 Familias génicas Familia génica:
“grupo de genes de un genoma que derivan de un ancestro común” Familia de las globinas (beta globina): 5 loci en HSA11 Orden según la expresión en el desarrollo Posición y longitud de intrones similar Evolución concertada

9 Familias de genes en tándem
Genes cuyos productos son requeridos en grandes cantidades: Organizador Nucleolar (NO): Localizado en los brazos cortos de cromosomas acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) aunque pueden traslocarse Contiene hasta 800 copias del gen del rRNA (18S + 28S) Genes del RNAt: 50 sitios cromosómicos 10 a 100 copias/sitio Genes de las Histonas Se mantiene la identidad de secuencia 2. Cromatina asociada al nucléolo. Organizador nucleolar     El organizador nucleolar es una estructura del cromosoma similar a una constricción secundaria del cromosoma metafásico, que en la interfase formará un nucléolo en torno a ella. Aparece como una constricción telomérica, constituyendo una región de fibrillas poco densas, más laxas que las de la cromatina. Esta constricción posee proteínas semejantes a las del nucléolo. Son fibras de cromatina empaquetadas de forma diferente a las del resto del cromosoma. El organizador nucleolar se encuentra separado del resto de la cromatina por heterocromatina telomérica. No aparece en todos los cromosomas del cariotipo de una especie, sólo en algunos (Cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22 del cariotipo humano). puede haber hasta 800 copias. En cada una de ellas hay unas 100 RNA polimerasas que trabajan en cadena. Por tanto, en un momento dado, pueden estar formándose a la vez moléculas idénticas de RNA. Puede decirse, por tanto, que el origen del rRNA (excepto el rRNA de 5S) está en un único gen y repetitivo. Esta multiplicidad de copias responde a una gran necesidad de síntesis de ribosomas en poco tiempo. Por eso, el organizador nucleolar puede fabricar multitud de copias cuando no basta él solo para producir el suficiente rRNA. Es más, es posible que no sea el organizador nucleolar, sino sus copias las que se transcriban, de modo que las posibilidades de deterioro del organizador nucleolar sean mucho menores.

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11 Familia de genes dispersos
Familias de genes dispersos: Actinas: de 5 a 30 genes Queratinas: + de 20 Cadena pesada de la Miosina: 5-10 Tubulinas: 3-15 Globinas: hasta 5 Región variable de las inmunoglobulinas: 500 Histonas: Las secuencias entre genes pueden variar Genes homólogos pueden tener funciones diferentes Algunos pierden la función  pseudogenes

12 Genoma

13 DNA repetido Secuencias de DNA no codificante dispersas y repetidas en tándem ¿DNA basura? - ¿Regulación de la expresión? ¿Mecanismo de reparación? ¿Puntos de recombinación?

14 Variación en el número de repeticiones
Entrecruzamiento desigual Fallo en la alineación de cadenas de DNA en la replicación

15 DNA repetido en tándem DNA satélite:
repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y algunas Mb) DNA no transcrito Regiones de heterocromatina, principalmente en centrómeros (DNA alfoide) Modelos de organización centromérica

16 DNA repetido en tándem DNA minisatélite (VNTR)
Repeticiones de tamaño moderado (60pb) Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros Normalmente no se transcriben Tipos: DNA minisatélite hipervariable DNA telomérico Función DNA telomérico: Solucionar los problemas de replicación de los extremos del cromosoma

17 DNA repetido en tándem DNA microsatélite (STR): Short Tandem Repeat
Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) Herencia mendeliana codominante CA Alelo 1 Alelo 2

18 DNA repetido en tándem VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición
Método detección Satélites 20 kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites (VNTR) 0,1-20 20-40 pb Elec. agarosa Microsatélites (STR) pb 1-4pb Elec. Acrilamida Secuenciación

19 DNA repetido en tándem VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición
Método detección Satélites 20 kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites (VNTR) 0,1-20 20-40 pb pb Elec. agarosa Microsatélites (STR) pb 1-4pb Elec. Acrilamida Secuenciación Polimorfismos de DNA: Presencia de distintos alelos en la población

20 Polimorfismo genético:
Polimorfismos Polimorfismo genético: Cuando un locus presenta al menos 2 alelos y la frecuencia alélica del más raro es > 5%  locus polimórfico. El polimorfismo (la variación) garantiza la adaptación de una especie a condiciones ambientales cambiantes, a expensas de producir mutaciones graves causantes de una enfermedad.

21 DNA minisatélite hipervariable
Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas Secuencia repetida común (core): GGGCAGGAXG Son muy polimórficas Se encuentran principalmente en intrones Estas secuencias se han empleado como “huellas dactilares” La secuencia repetida varía entre minisatélites (20-40 pb) pero todos tienen una secuencia común o core. Cómo tienen posiciones subteloméricas no se usan para cartografía. Están en intrones con excepciones. Ejemplo: mocus MUC1 en 1q codifica una glicoproteína altamente polimórfica como resultado de variaciones en el número de repeticiones.

22 DNA minisatélite hipervariable
Detección del polimorfismo: Digestión del DNA con enzimas de restricción + Southern (hibridación con sonda)

23 4 5 7 9 10 11 8 6 INDIVIDUO 1 1’ 3’ 1 1’ INDIVIDUO 2 3’ 2’ 2’

24 VNTRs

25 DNA minisatélite hipervariable
Funciones de los VNTRs: Regulación de puntos activos de recombinación Control de segregación de los cromosomas (por su localización centromérica) Estabilización de los cromosomas durante la replicación (por su localización en telómeros) Podrían dar estabilidad a los cromosomas Aplicaciones: Identificación individual (medicina forense)

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27 DNA microsatélite Localización dispersa en todos los cromosomas
Se encuentran en intrones y DNA espaciador, raramente en secuencia codificante. A veces asociados a secuencias repetidas dispersas por el genoma (SINES o LINES). Secuencia repetida de 1 a 4 pb. Son muy polimórficas. Las secuencias flanqueantes a la repetición son únicas.

28 Detección del polimorfismo: PCR

29 DNA microsatélite Visualización de los microsatélites:
ACGT Secuenciación: Genotipado:

30 Expansión de tetranucleótidos: DM2
DNA microsatélite Implicaciones de las secuencias microsatélites en medicina: Expansión de microsatélites de trinucleótidos: Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n Distrofia miotónica (DM) (CTG)n Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n Ataxia de Friedreich (FA) Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) Expansión de tetranucleótidos: DM2 Expansión de pentanucleótidos: SCA10

31 Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites:
DNA microsatélite Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites: Enfermedades de herencia recesiva  expansión de tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína) Enfermedades con herencia dominante  expansión de tripletes produce una proteína alterada Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes  expansiones en el ARN  función celular alterada? The first category, caused by a loss-of-function, is exemplified by the CGG and GAA expansions causing FMR and Friedreich's ataxia, respectively. For FMR, the hypermethylated CGG expansion at the 5′ end of the gene decreases transcription of the FMR1 gene, which leads to the absence of FMR1 protein (FMRP) [6]. For Friedreich's ataxia, an intronic GAA trinucleotide repeat interferes with mRNA formation and results in a concomitant reduction in the level of the protein product, frataxin [7]. These loss-of-function mutations are consistent with the recessive inheritance patterns of these disorders. A second mechanistic category involves the expansion of CAG trinucleotide repeats that are translated into extended polyglutamine tracts within the corresponding protein products. These dominantly-inherited diseases include Huntington's disease (HD), dentatorubro-pallidoluysian atrophy (DRPLA) and a number of spinocerebellar ataxias (SCA1, SCA2, SCA3, SCA7 and SCA17) [8 and 9]. There is strong evidence demonstrating that the expanded polyglutamine stretch confers either a gain- or change-of-function onto the corresponding protein products. A gain of function mechanism is consistent with the dominant inheritance pattern of these diseases [8] as well as the X-linked recessive pattern of inheritance for SBMA, although it is complicated by X-inactivation and lionization [10]. A third mechanistic category, and the topic of this review, involves non-coding microsatellite expansions that cause dominantly inherited disorders, including myotonic dystrophy types 1 and 2 (DM1 and DM2), SCA8, SCA10 and possibly SCA12 and Huntington's disease-like type 2 (HDL2). We discuss the growing body of evidence that microsatellite repeat expansions expressed at the RNA level play an important role in disease pathogenesis. A generalized mechanism of RNA pathogenesis has been proposed in which CUG-repeat-containing DMPK transcripts that accumulate as nuclear RNA foci alter the regulation of CUG-binding proteins, including CUG-BP [19] and muscleblind [22], altering their normal function [11]. There is direct evidence that CUG-repeat-induced alterations in CUG-BP result in the altered RNA splicing of several genes, including cardiac troponin T [20], the insulin receptor (IR) [45] and the chloride channel [46] which may contribute to various features of DM, including cardiac involvement, insulin insensitivity and myotonia, respectively.

32 Aplicaciones: DNA microsatélite Identificación individual
Análisis evolutivo de poblaciones Diagnóstico directo en enfermedades genéticas causadas por expansión de trinucleótidos Diagnóstico indirecto de enfermedades genéticas: Ligamiento entre microsatélites polimórficos y genes causantes de enfermedad.

33 Identificación individual
Análisis de 15 marcadores microsatélites

34 Diagnóstico directo Ejemplo: Diagnóstico corea de Huntington Nº repet
Clasificación E.H. <27 Normal No 27-35 Intermedio 36-39 Penetrancia I +/- >39 Penetrancia T Si 45 22 20 18 16 12 1 2 3 4 5 6 7

35 Diagnóstico indirecto
Fibrosis quística HSA7 CFTR Ms1 Ms2 Ms3 Ejemplo: Diagnóstico portadores enfermedades recesivas 127 125 ? 222 152 220 154 1 123 125 CFTR* 220 150 154 2 123 125 CFTR* 220 150 154 3 127 129 ? 222 152 218 4 123 129 ? 220 150 218 152 5 127 129 ? 222 152 218 6 CFTR* CFTR*

36 Resumen de polimorfismos genéticos
Etiología Detección Frecuencia genómica Microsatélites errores de DNAp PCR / bp (short tandem slippage repeats) STRs Minisatélites entrecruzamiento Southern variable, baja (variable no of no equilibrado tandem repeats) unequal crossing over VNTRs RFLPs mutaciones Southern-PCR baja (restriction fragment length polymorphisms) SNPs mutaciones PCR /1000 bp (Single nucleotide Polymorphisms)

37 Mutaciones Puntuales Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales:
Variación de un nucleótido en una posición determinada. Frecuencia:1/1000pb También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Alelo 1 Alelo 2 TACGAGCTA TACGGGCTA En regiones codificantes: Mutaciones con cambio aminoacídico GCA (Ala)  GTA (Val) Mutaciones sin sentido AAA (Lys)  TAA (stop) Mutaciones silentes GCA (Ala)  GCC (Ala) Mutaciones: Cambio de base Inserción Deleción

38 Metodología para determinar mutaciones puntuales
RFLPs: Mutaciones puntuales que se localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción. Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting PCR + enzima de restricción Baja variabilidad (2 alelos). Localización: Exones Genes de copia única SNP: Mutaciones puntuales detectable por un variado número de técnicas: Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte) Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real… Baja variabilidad (2 alelos) Localización: Exones DNA de copia única

39 RFLPs Determinación mediante Southern

40 Diagnóstico genético por RFLPs
AA Aa aa M s t I RFLP (Restriction fragment lenght polymorfism) Polimorfismo debido a mutaciones puntuales En el gen de la globina normal la secuencia correspondiente al 5th-7th aminoácido del péptido beta-globina es CCTGAGGAG que es reconocida por la enzima de restricción MstII. En la variable patológica de la anemia falciforme, eritrocitos en hoz-sickle, se produce una mutación puntual de A a T, lo que invalida el reconocimiento por MstII. En la correspondiente digestión enzimática se genera un único fragmento de 1,3 kb en lugar de los dos fragmentos de 0,2 kb y 1,1 kb propios del gen normal. Los diferentes fragmentos se detectan por técnica de Southern blotting Aa aa Aa AA aa aa Aa AA aa

41 Determinación mediante PCR-RFLPs
Mutación: Alelo 1 Alelo 2 TGGACGTCT TGGATGTCT Aat II PCR: TGGACGTCT TGGAGGTCT Fragmento PCR Electroforesis PCR Alelo 1 Alelo 2

42 Genética Médica RFLPs: SNP: Localización:
Según metodología de detección RFLPs: Mutaciones puntuales que se localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción. Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting PCR + enzima de restricción Baja variabilidad (2 alelos). Localización: Exones Genes de copia única SNP: Mutaciones puntuales detectable por un variado número de técnicas: Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte) Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real… Baja variabilidad (2 alelos) Localización: Exones DNA de copia única

43 SNPs SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:
Presentación muy frecuente (1/300 pb) 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano Dos posibles alternativas en cada individuo Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites) Fácil estandarización Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética

44 Determinación de SNPs Secuenciación:
PCR en tiempo real con sondas alelo específicas: MCL1 Minisecuenciación:

45 Mutaciones puntuales Implicaciones de las mutaciones puntuales en medicina: Pueden originar diferencias muy sutiles o provocar la muerte Mutaciones en líneas germinales: Neurofibromatosis (dominante) Acondroplasia (dominante) Hemofilia (Factor VII, ligado al X) Mutaciones somáticas: Cáncer: mutaciones de protooncogenes Origen: fallo en la reparación del DNA o agentes mutágenos

46 Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:
Genética Médica Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: Identificación individual (Medicina forense) Construcción de los mapas génicos Ligamiento con fenotipos

47 Ejemplo: Determinación de portadores de Fibrosis Quística
Nora Riveros Ka, Juan Ríos Hb (2005). Detección indirecta de portadores de fibrosis quística en dos familias chilenas mediante análisis de polimorfismos en el ADN asociados fuertemente al gen CFTR. Rev Méd Chile 2005; 133: