Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources Tema 3: Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (1999) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html

Objetivos: Identificar la utilidad del análisis de los marcadores de DNA para la construcción de mapas, la identificación individual y el aislamiento de genes de interés Conocer las metodologías que se han utilizado para la construcción de mapas Establecer la relación entre genómica y la nueva producción y sanidad animal

¿Qué es un polimorfismo? ¿cuáles conoces? ¿para qué puede servir el análisis de estos polimorfismos? ¿cómo se han construido los mapas del genoma? ¿para qué nos sirven?

Contenidos Introducción Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones Cartografía de los genomas, nuevas herramientas Identificación de un gen Estrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humano Mapas genómicos de especies domésticas Genómica funcional

Genómica ESTRUCTURAL: FUNCIONAL: Caracterización molecular de genomas completos ESTRUCTURAL: Caracterización de la naturaleza física de genomas completos FUNCIONAL: Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica Proteomaconjunto completo de genes de un genoma que determinan proteínas. Estructural saber qué genes hay, qué marcadores. La tecnología del DNA, unido a avances informáticos, ha permitido el desarrollo de una serie de tecnologías que nos permiten analizar en un mismo experimento la expresión de miles de genes o la variación de cientos de variantes genéticas en un elevado número de individuos en relativamente poco tiempo y dinero. Estos avances se han utilizado para la construcción del genoma, para determinar procesos moleculares complejos que dan lugar a las enfermedades o para la asociación entre polimorfismos y enfermedades. Actualmente la industria farmacéutica incluso pretende identificar variantes individuales que hacen que unos individuos respondan bien a un tratamiento y otros no.

Clasificación del DNA eucariota Genómica estructural Caracterización de la naturaleza física de genomas: - Polimorfismos del DNA - Cartografía Clasificación del DNA eucariota Genómica estructural: Caracterización de la naturaleza física de genomas físicos Si os acordais de la clasificación del DNA eucariota que dábamos a principios de curso, había toda una serie de DNA repetido sin función conocida, bien, vamos a volver a recordar este tipo de DNA pero desde otra perspectiva, desde el punto de vista de polimorfismo o variante genética.

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Polimorfismo genético Existencia de distintos alelos: Polimorfismo bioquímico: Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas Polimorfismos del DNA: Variaciones presentes en la secuencia de bases Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales Polimorfismos del número de repeticiones en tándem Polimorfismo  existencia de distintas formas. Los polimorfismos genéticos han ido variando a lo largo del tiempo, en un primer lugar se hablaba de diferencias fenotípicas (semilla lisa, semilla rugosa). Estas variantes se asociaron a variantes alélicas de los genes. Conforme fueron avanzando las técnicas analíticas, pasamos a poder analizar otro tipo de polimorfismos, otro tipo de variaciones que tuvieran su origen en el genoma y surgieron los polimorfismos bioquímicos. Podíamos analizar proteínas, ver sus diferencias en la migración por electroforesis (debidas a cambios de carga que a su vez se deben a cambios aminoacídicos y, por tanto, a cambios en el gen). Finalmente, la tecnología del DNA recombinante nos ha llevado a poder analizar directamente el DNA, no sus productos. Así, se ha ampliado de gran manera un número de polimorfismos genéticos que podemos analizar y, con ello, ampliar las aplicaciones de la utilización de los mismos. Estos polimorfismos a veces no tienen ningún significado biológico pero veremos que nos pueden ser de gran utilidad.

Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales Variación de un nucleótido en una posición determinada. Frecuencia:1/1000pb También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Cambios de bases: Transiciones: Purina Purina: Pirimidina Pirimidina: Transversiones PurinaPirimidina: Pirimidina Purina Alelo 1 Alelo 2 TACGAGCTA TACGGGCTA A G Purinas T C Pirimidinas Mutación puntual es la que afecta únicamente a un nucleótido, supone la sustitución de un nucleótido por otro. Ya vimos en un tema anterior que consecuencias pueden tener estas mutaciones, cambios de proteínas o no si son silentes. En este tema las veremos únicamente como polimorfismos. Estas mutaciones puntuales son muy frecuentes ya que no tenemos en cuenta únicamente aquellas que se encuentran en regiones codificantes sino también aquellas que se encuentran en el DNA espaciador o en intrones, aún así, van a ser útiles.

SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb) 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano Dos posibles alternativas en cada individuo Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites) Fácil estandarización Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética

RFLPs-SNP RFLPs Origen: mutaciones puntuales Variabilidad: 2 alelos Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador RFLPs Detección mediante enzimas de restricción: Southern Blot PCR+RFLP Normalmente determinados en exones Detección de los SNP: RFLP: Southern Blot PCR + RFLP Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real… RFLPs se identifican principalmente en exones porque de ellos conocemos las secuencias para crear sondas. Sin embargo, cualquier fragmento de DNA genómico nos serviría para detectar RFLPs, independientemente de si se trata de región codificante o no.

Detección de mutaciones puntuales RFLP: Alelo 1 Alelo 2 TGGACGTCT TGGATGTCT Aat II Sonda Alelo 1 Alelo 2 MCL1 Primera: PCR+RFLP, tenemos un fragmento amplificado en el cual sabemos que hay un polimorfismo que puede ser detectado por una enzima de restricción. Si está la secuencia la corta y nos da dos bandas y si no dará sólo una. Esto lo verán los alumnos en práticas, con la detección del SSP mediante esta técnica. Cuando no conocemos la secuencia del gen pero tenemos una sonda de otra especie y buscamos polimorfismo mediante esta técnica podemos realizar un southern blot. (tecnica descrita en el tema referente al DNA recombinante, al final). Simplemente decir que se puede detectar por esta técnica.

Detección de mutaciones puntuales Minisequencing Explicar la minisecuenciación. Como se visualiza: electroforesis capilar o en microarray

Introducir que pueden servir como marcadores para diagnosticar una enfermedad. Explicar el ejemplo y recordar la recombinación.

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición Método detección Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites 0,1-20 20-40 pb Elec. Agarosa Southern Microsatélites pb 1-4pb Elec. Acrilamida Secuenciación

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem DNA satélite: repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y algunas Mb) DNA no transcrito Regiones de heterocromatina, principalmente en centrómeros (DNA alfoide) DNA minisatélite Repeticiones de tamaño moderado (60pb) Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros Normalmente no se transcriben Tipos: DNA minisatélite hipervariable DNA telomérico

DNA minisatélite hipervariable Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas Secuencia repetida común (core): GGGCAGGAXG Son muy polimórficas Se encuentran en intrones Estas secuencias se han empleado como “huellas dactilares” Los minisatélites se determinan mediante “RFLPs” + Southern  corte con enzimas de restricción y determinación de los fragmentos hibridando con una sonda que reconoce la secuencia “core” En la diapositiva se muestra un punto concreto de un cromosoma, pero tened en cuenta que en un cromosoma puede haber muchos más minisatélites

VNTRs Una de las primeras sondas VNTR que se detectó se obtuvo a partir de una repetición en tándem que había en un intrón del gen de la mioglobina humana. Posteriormente se vio que la región central se encontraba en muchos otros minisatélites si bien la secuencia que se repetía podía tener un tamaño distinto y no tenía por qué ser igual en distintos VNTR. Debido a la gran variabilidad observada se convirtieron en unas herramientas de gran valor en el análisis de la individualidad genética.

4 5 7 9 10 11 8 6 INDIVIDUO 1 1’ 3’ 1 INDIVIDUO 2 3’ 2’ 2’ INDIVIDUO 1

Fingerprints

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem DNA microsatélite (STR): Short Tandem Repeat Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) Herencia mendeliana codominante CA Alelo 1 Alelo 2

Visualización de los microsatélites Genotipado: ACGT Secuenciación:

Los microsatélites también los podemos usar como marcadores asociados a fenotipos concretos, por ejemplo una enfermedad. No sabemos qué mutación produce la enfermedad pero si tiene un marcador asociado podemos seguir ese marcador en una filogenia y ver con qué alelo está ligado.

Expansión de tetranucleótidos: DM2 Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: Expansión de microsatélites de trinucleótidos: Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n Distrofia miotónica (DM) (CTG)n Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n Ataxia de Friedreich (FA) Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) Expansión de tetranucleótidos: DM2 Expansión de pentanucleótidos: SCA10 Aunque la función de los microsatélites no es conocida, se han aportado distintas hipótesis desde no tener función a tener algún tipo de participaión en: Regulación de puntos activos de recombinación Control de segregación de los cromosomas (por su localización centromérica) Estabilización de los cromosomas durante la replicación (por su localización en telómeros) Podrían dar estabilidad a los cromosomas Además se han implicado algunos microsatélites a enfermedades concretas, como causantes de las mismas. No se conocen enfermedades animales producidas por microsatélites. Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites: Enfermedades de herencia recesiva ligada al X  expansión de tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína) Enfermedades con herencia dominante  expansión de tripletes produce una proteína alterada Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes  expansiones en el ARN  función celular alterada? Enfermedades humanas se han creado animales modelo

Secuencias de DNA dispersas ¿DNA basura? - ¿Regulación de la expresión? ¿Mecanismo de reparación? ¿Puntos de recombinación?

Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: Diagnóstico genético Ligamiento con fenotipos Identificación individual Construcción de los mapas génicos

Técnicas básicas: Extracción del DNA genómico Electroforesis Hibridación (Southern, Northern) Restriction Fragment Lenght Polymorphism Reacción en Cadena de la Polimerasa Secuenciación (método de Sanger) Clonación

Diagnóstico genético directo: Mutaciones puntuales  Inserciones, deleciones  Repeticiones en tándem  Transcripción diferencial  Procesamiento alternativo del RNA Metilación  RFLPs, Secuenciación, chips PCR, Southern PCR, secuenciación RT-PCR, Northern, chips RT-PCR, North. MPCR MPCR Esta técnica consiste en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) posterior al tratamiento del DNA genómico con bisulfito sódico.  El bisulfito sódico convierte las bases del DNA llamadas citosinas en otras distintas llamadas uracilos, si dichas citosinas no se encuentran metiladas.  Esta estrategia permite diferenciar el alelo materno (metilado) y el paterno (no metilado).

Diagnóstico genético indirecto: Análisis de marcadores genéticos X Gen alterado Mutación puntual Microsatélite RFLP Deleción Inserción Marcador polimórfico Genotipo del marcador  Genotipo del gen dañado

Control de libros genalógicos Identificación individual: Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos) Análisis de marcadores microsatélites PCR, secuenciación Fingerprinting (minisat.) Microsatélites Minisatélites Control de filiación Control de libros genalógicos Detección mediante RFLP + Southern

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Mapas del genoma: Mapa genético Mapa físico Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis Mapa físico Posición exacta de un gen Distancia entre marcadores determinada por nº de pb

Mapas genéticos Existencia de polimorfismo en los genes a mapear Análisis de familias “informativas” (AaBb x AABB) Requerimientos Estudios de ligamiento : Herencia ligada al cromosoma X Marcadores polimóficos asignados a paneles de familias Alozimas Polimorfismos del ADN (microsatélites, RFLPs) Caza de genes relacionados con enfermedades o caracteres productivos: Fibrosis Quística (9 años) humano

Mapas físicos Cromosoma (paneles de células híbridas somáticas) Banda cromosómica (FISH) Células híbridas irradiadas Secuencia nucleotídica Resolución

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Estrategias para la identificación de un gen Identificación del fenotipo Clonado posicional Clonado funcional Gen candidato Mapa Función Gen Gen Gen Mapa Mutaciones Mutaciones Mutaciones Función Mapa Función

Identificación de un gen Identificación clásica Genómica Estudios en familias (modo de herencia) Estudios de expresión gen Análisis de ligamiento o mapa físico (identificación de la región cromosómica) mutaciones Acotar la zona cromosómica (clonaje en YAC) Análisis de los clones (contigs, búsqueda de marcadores, ORF, mutaciones) gen Estudios de expresión

Gen de doble musculatura Crecimiento anormal del tejido muscular debido a una hipertrofia (=hiperplasia) 20% más de rendimiento de carne Aumento de cortes con gran valor económico Carne magra Muy buena conversión alimentaria Dificultades en el parto Azul Belga Piamontesa Limusina Charolés Asturiana de los Valles Hiperplasia se consigue con ejercicio 1995: Carácter controlado por un gen mayor mh

Gen de doble musculatura ¿mh? Identidad? Localización cromosómica MYOS 2q11 MYOS-/- Azul Belga x Frisona Rastreo del genoma con microsatélites Región BTA2 próxima centrómero Miostatina Gen candidato

Herencia autosómica recesiva Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura Descripción Tipo de mutación Raza inserción/deleción en la posición 418 Corrimiento en el marco de lectura Belgian blue, Asturianas, Rubia Gallega, Aubrac transición C  T en la posición 610 Sin sentido - terminación prematura de la proteína Charoláis transversión G  T en la posición 676 Maine-Anjou, Parthenais Deleción de 11 pb desde la posición 821 hasta la 831 Corrimiento en el marco de lectura - terminación prematura de la proteína Belgian blue, Limousine, South Devon, Asturiana de los Valles transición G  A en la posición 938 Transversión consentido. Cys  Tyr en la proteina Piemontese, Gascon Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales transversión C  A en la posición 282 Mutación consentido. Phe  Leu en la proteina Limousine, Aubrac, Devon, Pirenaica transición C  T en la posición 414 Transición silente – sin cambio en la proteína Ampliamente distribuida Tipificación de animales: Diagnóstico indirecto: - microsatélites Diagnóstico directo: - mutaciones MYOS

Ligamiento vs asociación Identificación de regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias) Análisis de 500 pols Regiones candidatas y acotamiento de la región Alelos raros de alto riesgo Asociación: Análisis de individuos afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos Facilidad para la obtención de muestras Necesidad de analizar miles de marcadores Alelos de acción modesta en enfermedades comunes

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Mapa genómico: Representación lineal de los sitios genómicos importantes (genes y marcadores) 1990: Proyecto Genoma Humano (National Institute of Health and the Department of Energy, USA) Mapear y secuenciar el genoma humano Construcción del mapa físico y genético Determinar la secuencia de 3000 millones de caracteres del DNA humano con un 99.9% de fiabilidad Determinar y localizar las variaciones del DNA entre individuos (polimorfismos) Localizar todos los genes humanos Establecer las funciones de estos genes y otras partes del genoma

Mapear y secuenciar los genomas de animales modelo: E. coli (4,6 millones pb) S. cerevisiae (12 millones pb) C. elegans (97 millones pb) D. melanogaster (165 millones pb) M. musculus (3000 millones) Otros Recolectar y distribuir datos: Publicar en 24 h toda secuencia >2000pb Crear bases de datos Desarrollar programas de análisis de DNA Desarrollar herramientas para comparar e interpretar la información genómica Compartir la información públicamente Estudiar los aspectos éticos, legales y sociales de la investigación en genética Entrenamiento de investigadores Desarrollo de tecnologías

“The end of the begining” 2003: Genoma completado Desarrollar el catálogo definitivo de genes codificantes de proteínas Utilizar la genómica comparativa para alinear el genoma humano con el de otras especies para la identificación de genes Encontrar los elementos funcionales que controlan el tiempo y nivel de expresión de genes y micro-RNAs Secuenciar el restante 20% de heterocromatina (problemas de repeticiones) “The end of the begining”

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Mapas genómicos en especies domésticas Mapas de ligamiento, ricos en marcadores de DNA Mapas físicos, ricos en genes conservados (permiten el mapeo comparativo) Unión de ambos mapas Mapas de EST (Expressed Sequence Tag) Mapas de alta resolución en cromosomas específicos Identificación de genes candidatos y regiones con QTLs

Mapas genómicos en especies domésticas Australian Sheep Gene mapping Web site http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm BovMap database http://locus.jouy.inra.fr/cgi-bin/bovmap/intro2.pl Pig base http://www.thearkdb.org/browser?species=pig Dogmap http://www.dogmap.ch/

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Genómica funcional Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas Identificación de su función Empleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulación génica ORF: tramos de lectura abierta. A través de programas informáticos podemos determinar si una determinada secuencia contiene algún fragmento que pudiera dar lugar a un mensajero, fragmentos que empiecen por el codón AUG y terminen con un codón fin de mensaje. Cualquier ORF de al menos 100 codones se considera como un posible gen. Para identificar la función de estos genes se puede utilizar la mutagénesis in vitro, para anular la expresión del gen o para la obtención de cualquier fenotipo mutante que nos pueda dar pistas sobre su función. Muchas ORF cuando se eliminan no dan fenotipos detectables, otros son de gran importancia. Al igual que los chips de silicio han revolucionado la industria de los ordenadores, estos chips de DNA están revolucionando la investigación en genética.

Chips de DNA Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos) Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.) Se miden variaciones en la expresión de los tejidos

Aplicaciones de la Genómica Conocimiento y comprensión de procesos patológicos Precisión de diagnóstico: Clasificación más fina (cáncer de colon, piel) “Farmacogenómica”  respuesta individual a tratamientos, elección de quimioterapia Evaluación correcta del riesgo genético: Predicción de la agresividad tumoral Prevención conocido el riesgo genético Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..

Implicaciones del conocimiento del genoma Análisis de recién nacidos Detección de portadores Desarrollo de terapias: Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional Terapia basada en la genética: Diseño de nuevas drogas Tratamientos basados en las bases moleculares Elección del tratamiento Identificación de genes con interés en producción.

Videos de genómica Microarray: http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6-Jgcg&feature=related ¿Qué falta aquí? http://www.youtube.com/watch?v=6iFDphWXjw4&feature=related