Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources

Presentación del tema: "Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources"— Transcripción de la presentación:

1 Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources
Tema 12: Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources Inma Martín-Burriel:

2 Contenidos Introducción Genómica estructural Genómica funcional
Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio Aplicaciones de los polimorfismos Genómica funcional

3 Definiciones Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. Es una de las áreas más vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc. Genomics is a discipline in genetics concerning the study of the genomes of organisms. The field includes intensive efforts to determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale genetic mapping efforts. The field also includes studies of intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis, pleiotropy and other interactions between loci and alleles within the genome.

4 Historia de la Genómica
1977: Secuenciación completa del genoma de nt del virus ØX174 (Sanger et al.) Desarrollo de métodos de secuenciación: secuencia de genomas eucarióticos.

5 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert
Métodos de terminación de la cadena o método de Sanger Pirosecuenciación Secuenciación a gran escala (NGS)

6 GENÓMICA Estructural Funcional Comparativa
Secuencia descubrimiento genes, localización Función de los genes Regulación Comparativa Compara genomas de diversas especies para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas. Desarrollo de organismos modelo de enfermedades

7 Genómica ESTRUCTURAL: FUNCIONAL:
Caracterización molecular de genomas completos ESTRUCTURAL: Caracterización de la naturaleza física de genomas completos FUNCIONAL: Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica Proteomaconjunto completo de genes de un genoma que determinan proteínas. Estructural saber qué genes hay, qué marcadores. La tecnología del DNA, unido a avances informáticos, ha permitido el desarrollo de una serie de tecnologías que nos permiten analizar en un mismo experimento la expresión de miles de genes o la variación de cientos de variantes genéticas en un elevado número de individuos en relativamente poco tiempo y dinero. Estos avances se han utilizado para la construcción del genoma, para determinar procesos moleculares complejos que dan lugar a las enfermedades o para la asociación entre polimorfismos y enfermedades. Actualmente la industria farmacéutica incluso pretende identificar variantes individuales que hacen que unos individuos respondan bien a un tratamiento y otros no.

8 Clasificación del DNA eucariota
Genómica estructural Caracterización de la naturaleza física de genomas: - Polimorfismos del DNA - Cartografía Clasificación del DNA eucariota DNA eucariótico Genes funcionales de copia única DNA de secuencia repetida DNA separador Secuencias funcionales Secuencias sin función conocida No codificantes Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) Familias de genes dispersos Familias de genes en tándem Repeticiones heterocromatina Del centrómero VNTR Secuencias derivadas De transposiciones Transposones Retrotransposones Genómica estructural: Caracterización de la naturaleza física de genomas físicos Si os acordáis de la clasificación del DNA eucariota que dábamos a principios de curso, había toda una serie de DNA repetido sin función conocida, bien, vamos a volver a recordar este tipo de DNA pero desde otra perspectiva, desde el punto de vista de polimorfismo o variante genética.

9 Polimorfismo genético
Polimorfismo: Variante genética que aparece en la población con una frecuencia > 1% Polimorfismo bioquímico: Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas Polimorfismos del DNA: Variaciones presentes en la secuencia de bases Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales Polimorfismos del número de repeticiones en tándem Polimorfismo  existencia de distintas formas. Los polimorfismos genéticos han ido variando a lo largo del tiempo, en un primer lugar se hablaba de diferencias fenotípicas (semilla lisa, semilla rugosa). Estas variantes se asociaron a variantes alélicas de los genes. Conforme fueron avanzando las técnicas analíticas, pasamos a poder analizar otro tipo de polimorfismos, otro tipo de variaciones que tuvieran su origen en el genoma y surgieron los polimorfismos bioquímicos. Podíamos analizar proteínas, ver sus diferencias en la migración por electroforesis (debidas a cambios de carga que a su vez se deben a cambios aminoacídicos y, por tanto, a cambios en el gen). Finalmente, la tecnología del DNA recombinante nos ha llevado a poder analizar directamente el DNA, no sus productos. Así, se ha ampliado de gran manera un número de polimorfismos genéticos que podemos analizar y, con ello, ampliar las aplicaciones de la utilización de los mismos. Estos polimorfismos a veces no tienen ningún significado biológico pero veremos que nos pueden ser de gran utilidad.

10 Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem
VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición Método detección Satélites 20 kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites 0,1-20 20-40 pb Elec. Agarosa Southern Microsatélites pb 1-4pb Elec. Acrilamida Secuenciación

11 Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem
DNA microsatélite (STR): Short Tandem Repeat Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) Herencia mendeliana codominante CA Alelo 1 Alelo 2

12 Visualización de los microsatélites
Genotipado: ACGT Secuenciación:

13 Expansión de tetranucleótidos: DM2
Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: Expansión de microsatélites de trinucleótidos: Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n Distrofia miotónica (DM) (CTG)n Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n Ataxia de Friedreich (FA) Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) Expansión de tetranucleótidos: DM2 Expansión de pentanucleótidos: SCA10 Aunque la función de los microsatélites no es conocida, se han aportado distintas hipótesis desde no tener función a tener algún tipo de participaión en: Regulación de puntos activos de recombinación Control de segregación de los cromosomas (por su localización centromérica) Estabilización de los cromosomas durante la replicación (por su localización en telómeros) Podrían dar estabilidad a los cromosomas Además se han implicado algunos microsatélites a enfermedades concretas, como causantes de las mismas. No se conocen enfermedades animales producidas por microsatélites. Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites: Enfermedades de herencia recesiva ligada al X  expansión de tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína) Enfermedades con herencia dominante  expansión de tripletes produce una proteína alterada Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes  expansiones en el ARN  función celular alterada? Enfermedades humanas se han creado animales modelo

14 Secuencias de DNA dispersas
¿DNA basura? ¿DNA egoista? - ¿Regulación de la expresión? ¿Puntos de recombinación? Control de la segregación de cromosomas (centrómeros) Estabilización de los cromosomas en la replicación (telómeros)

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16 ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements:
Protein or non-coding RNA Protein binding Specific chromosome structure

17 Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales
Variación de un nucleótido en una posición determinada. Frecuencia:1/1000pb También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Cambios de bases: Transiciones: Purina Purina: Pirimidina Pirimidina: Transversiones PurinaPirimidina: Pirimidina Purina Alelo 1 Alelo 2 TACGAGCTA TACGGGCTA A G Purinas T C Pirimidinas Mutación puntual es la que afecta únicamente a un nucleótido, supone la sustitución de un nucleótido por otro. Ya vimos en un tema anterior que consecuencias pueden tener estas mutaciones, cambios de proteínas o no si son silentes. En este tema las veremos únicamente como polimorfismos. Estas mutaciones puntuales son muy frecuentes ya que no tenemos en cuenta únicamente aquellas que se encuentran en regiones codificantes sino también aquellas que se encuentran en el DNA espaciador o en intrones, aún así, van a ser útiles.

18 SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:
Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb) 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano Dos posibles alternativas en cada individuo Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites) Fácil estandarización Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética

19 RFLPs-SNP RFLPs Origen: mutaciones puntuales Variabilidad: 2 alelos
Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador RFLPs Detección mediante enzimas de restricción: Southern Blot PCR+RFLP Normalmente determinados en exones Detección de los SNP: RFLP: Southern Blot PCR + RFLP Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real… RFLPs se identifican principalmente en exones porque de ellos conocemos las secuencias para crear sondas. Sin embargo, cualquier fragmento de DNA genómico nos serviría para detectar RFLPs, independientemente de si se trata de región codificante o no.

20 Detección de mutaciones puntuales
RFLP: Alelo 1 Alelo 2 TGGACGTCT TGGATGTCT Aat II Sonda Alelo 1 Alelo 2 MCL1 Primera: PCR+RFLP, tenemos un fragmento amplificado en el cual sabemos que hay un polimorfismo que puede ser detectado por una enzima de restricción. Si está la secuencia la corta y nos da dos bandas y si no dará sólo una. Esto lo verán los alumnos en práticas, con la detección del SSP mediante esta técnica. Cuando no conocemos la secuencia del gen pero tenemos una sonda de otra especie y buscamos polimorfismo mediante esta técnica podemos realizar un southern blot. (tecnica descrita en el tema referente al DNA recombinante, al final). Simplemente decir que se puede detectar por esta técnica.

21 Detección de mutaciones puntuales
Minisequencing Explicar la minisecuenciación. Como se visualiza: electroforesis capilar o en microarray

22 Marcador del DNA (genético)
Gen o secuencia de DNA cuya localización en el genoma se conoce. Características: Tienen que ser polimórficos (en la población). Si es un gen no interesa la función sino las variaciones en el DNA (que pueden reflejarse en diferencias funcionales) (ej. Grupo sanguíneo). HAY POCOS GENES MARCADORES. Las variaciones en un segmento de DNA se transmiten según las reglas Mendelianas de codominancia. HAY MUCHAS SECUENCIAS MARCADORES. I. Genetic markers are inherited variations that can be used to understand genetic events. They have a number of applications. A. In order to be useful as a marker, the inherited variations must be polymorphic, i.e. there must be two or more common variations in the population under study. Monomorphic sites/genes have only one common form and therefore are not useful as markers. B. A genetic marker can be a functional gene. However, it is not the function that is of interest but the variations in DNA structure that are reflected in functional differences between alleles. For example, blood groups can be used in gene mapping or to resolve issues of identity, paternity, or who committed a crime. The biological function of blood groups is not related to these applications. C. A genetic marker can also be a segment of DNA that has no known function or that is known not to have a function. So long as that DNA varies among homologous chromosomes, it can serve as a genetic marker that is transmitted according to Mendelian rules for codominant alleles. D. There are some dozens of polymorphic functional genes that are useful as markers. By contrast, there are thousands of polymorphic DNA sites that are useful as markers.

23 Tipos de marcadores SNP (or Single nucleotide polymorphism)
RFLP (or Restriction fragment length polymorphism) RAD markers (or Restriction site associated DNA markers) AFLP (or Amplified fragment length polymorphism) VNTR (or Variable number tandem repeat) Microsatellite polymorphism, SSR (or Simple sequence repeat) STR (or Short tandem repeat) SSLP (or Simple sequence length polymorphism) RAPD (or Random amplification of polymorphic DNA) SFP (or Single feature polymorphism) DArT (or Diversity Arrays Technology) Restriction site Associated DNA (RAD) markers are a type of genetic marker that can be used for genetic mapping. The use of RAD markers for genetic mapping is often called RAD mapping. An important aspect of RAD markers and mapping is the process of isolating RAD tags, which are the DNA sequences that immediately flank each instance of a particular restriction enzyme site throughout the genome.[1] Once RAD tags have been isolated, they can be analyzed to identify and/or genotype DNA sequence polymorphisms such as single nucleotide polymorphisms (SNPs).[1] Polymorphisms that are identified and genotyped by isolating and analyzing RAD tags are referred to as RAD markers. Hybridization-based arrays have been used to address a broad range of questions related to genomic variation [29], such as the identification of natural variation between closely related organisms [30]. Tiling arrays hold sets of microarray hybridization probes that contain both genic and non-genic portions of the genome and can be used to discover polymorphisms throughout the entire genome. Such polymorphisms are called single feature polymorphisms (SFPs) because they differ from a common reference sequence. Although the exact nature of polymorphism in SFPs is difficult to identify they have been established to be a useful alternative to the genotyping of single nucleotide polymorphisms (SNPs) [31] DArT is based on microarray hybridizations that detect the presence versus absence of individual fragments in genomic representations[1]. The technology has significant advantages over other array based Single-nucleotide polymorphism detection technologies in the analysis of polyploid plants[2].

24 Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:
Diagnóstico genético Identificación individual Construcción de los mapas génicos Ligamiento con fenotipos

25 Diagnóstico genético indirecto: Análisis de marcadores genéticos
X Gen alterado Mutación puntual Microsatélite RFLP Deleción Inserción Marcador polimórfico Genotipo del marcador  Genotipo del gen dañado

26 Introducir que pueden servir como marcadores para diagnosticar una enfermedad. Explicar el ejemplo y recordar la recombinación.

27 Los microsatélites también los podemos usar como marcadores asociados a fenotipos concretos, por ejemplo una enfermedad. No sabemos qué mutación produce la enfermedad pero si tiene un marcador asociado podemos seguir ese marcador en una filogenia y ver con qué alelo está ligado.

28 Control de libros genalógicos
Identificación individual: Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos) Análisis de marcadores microsatélites PCR, secuenciación Fingerprinting (minisat.) Microsatélites Minisatélites Control de filiación Control de libros genalógicos Detección mediante RFLP + Southern

29 Mapas del genoma: Mapa genético Mapa físico
Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis Mapa físico Posición exacta de un gen Distancia entre marcadores determinada por nº de pb

30 Secuenciación de genomas
Construcción de librerías PCR en puente Secuenciación por síntesis

31 Análisis bioinformático (NGS)
Preprocesado de las secuencias Control de calidad Alineamiento de secuencias: formación de contigs Alineamiento con las referencias Búsqueda de variantes

32 Ligamiento con fenotipos
Asociación: Análisis de individuos afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos Facilidad para la obtención de muestras Necesidad de analizar miles de marcadores Alelos de acción modesta en enfermedades comunes Ligamiento con fenotipos Ligamiento: Identificación de regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias) Análisis de 500 pols Regiones candidatas y acotamiento de la región Alelos raros de alto riesgo

33 Secuenciación del Exoma
Alineamiento con secuencias de referencia Eliminación de variantes comunes (dbSNP, HapMap8) Secuenciando 3 o 4 individuos mutación causante Riesgo de falsos negativos Estudio de ligamiento + NGS (secuenciando familia e identificando los fragmentos cromosómicos heredados de los padres) Confirmación con pruebas bioquímicas y funcionales

34 Genómica funcional Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas Identificación de su función Empleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulación génica ORF: tramos de lectura abierta. A través de programas informáticos podemos determinar si una determinada secuencia contiene algún fragmento que pudiera dar lugar a un mensajero, fragmentos que empiecen por el codón AUG y terminen con un codón fin de mensaje. Cualquier ORF de al menos 100 codones se considera como un posible gen. Para identificar la función de estos genes se puede utilizar la mutagénesis in vitro, para anular la expresión del gen o para la obtención de cualquier fenotipo mutante que nos pueda dar pistas sobre su función. Muchas ORF cuando se eliminan no dan fenotipos detectables, otros son de gran importancia. Al igual que los chips de silicio han revolucionado la industria de los ordenadores, estos chips de DNA están revolucionando la investigación en genética.

35 Chips de DNA Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos) Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.) Se miden variaciones en la expresión de los tejidos

36 Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq.
Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq. (a) Calculation of gU and iU tables. First, all possible APEs are computationally made from the transcriptome sequence. The length d of an APE is fixed at each round. APEs are mapped back to the transcriptome sequence and classified into groups representing gene-wise (orange) and isoform-wise (green and violet) informative reads. APEs mapped on multiple genes (grey) are not used. For each mRNA isoform, APEs specific to the isoform are counted (iUd,i). For each gene, gene-wise informative APEs are counted (gUd,g). This procedure (from extraction of APEs to calculation of iUd,i and gUd,g) is repeated for every d, ranging from 37 to 250 bp in case of the 36-bp data. As a result, we obtain matrices gUd,g and iUd,i. (b) Calculation of EUMA and expression levels. Real RNA-Seq reads are mapped to the transcriptome sequence. For each gene gEUMA is computed by averaging gUd,i over all d, with weight P(d). iEUMA is computed likewise. P(d) is the probability distribution obtained from all mapped reads from the experiment. Then, for each gene, reads that are mapped to all of the gene's mRNA isoforms and not mapped to any other mRNA isoforms are counted (gNIR). Likewise, for each mRNA isoform, reads that are specifically mapped to the mRNA isoform are counted (iNIR). Finally, gNIR and iNIR are divided by gEUMA and iEUMA, to produce the mRNA abundance at the gene and isoform levels, respectively. Lee S et al. Nucl. Acids Res. 2010;nar.gkq1015 © The Author(s) Published by Oxford University Press.

37 Aplicaciones de la Genómica
Conocimiento y comprensión de procesos patológicos Precisión de diagnóstico: Clasificación más fina (cáncer de colon, piel) “Farmacogenómica”  respuesta individual a tratamientos, elección de quimioterapia Evaluación correcta del riesgo genético: Predicción de la agresividad tumoral Prevención conocido el riesgo genético Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..

38 Implicaciones del conocimiento del genoma
Análisis de recién nacidos Detección de portadores Desarrollo de terapias: Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional Terapia basada en la genética: Diseño de nuevas drogas Tratamientos basados en las bases moleculares Elección del tratamiento Identificación de genes con interés en producción.

39 Videos de genómica Microarray:
Exon Sequencing