BIOLOGÍA MOLECULAR Erase una vez… Dr. GERARDO DANIEL DELUCA Laboratorio de Aplicaciones Moleculares Facultad de Medicina-UNNE

Los primeros pasos … PCR ADN Electroforesis QUENCHER ARRAYS ARN RFLP Hibridación Secuenciación DOT BLOT NASBA Clonación HIBRIDACIÓN REVERSA

El gran ninguneado de la microbiología se toma revancha… Molar mMolar - uMolar L /mL/uL uLitro Grs/mgrs nGrs / fGrs. Moles mMoles /nMoles

Dogma central de la biología molecular DNA  RNA  PROTEINAS F. Crick

El código genético

Principales descubrimientos y avances de la era molecular 1960  Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa  Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA. 1962  Arber aisla y purifica las enzimas de restricción. 1967  Se descubre la ADN ligasa 1972  Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación 1975  Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas 1977  Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert) 1981  Primeros animales transgénicos 1985  Invención de la PCR (Kary Mullis) 1997  Secuenciación de genomas bacterianos completos 2001  Secuenciación del Genoma Humano

Aplicaciones de la Biología Molecular ¿Cuál será la influencia probable de la biología molecular sobre el porvenir de la medicina? Los virus y las enfermedades virales Desórdenes metabólicos hereditarios Malformaciones adquiridas, congénitas y estructurales Cáncer Edward L. Tatum, Atomes 1968 Biotecnología (industria, animales, vegetales, microorganismos) Clonación de órganos y animales Medicina humana y veterinaria (diagnóstico y terapia génica) Medicina Personalizada Identificación de personas  huella genética Paleontología

PRINCIPALES APLICACIONES DE LA PCR INVESTIGACIONES PALEONTOLÓGICAS Y DE FÓSILES INVESTIGACIONES FORENSES MEDICINA HUMANA

PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos) TIPOS DE PCR CONVENCIONAL PCR común Nested PCR Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos) Heminested PCR PCR de baja astringencia (RAPD PCR) RT-PCR

AMPLIFICACIÓN Más ampliamente utilizada PCR Más ampliamente utilizada Distintos formatos caseros y comerciales NASBA Comercial Cargas virales y monitoreo bDNA

MANUALES AUTOMATIZADOS EXTRACCIÓN DE ADN O ARN MANUALES Con solventes Sin solventes AUTOMATIZADOS Robotizados Magnéticos y de vacío

Hibridación con sondas marcadas DETECCIÓN Electroforesis Hibridación con sondas marcadas LIPA Fluorescencia RLB ELISA

Metodología utilizada: HC V Metodología utilizada: RT-PCR anidada de la región 5´no codificante (5´NC) del genoma viral combinada con el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)  100pb  ACRILAMIDA / Nitrato plata 251pb AGAROSA / BrEt

HPV PCR-RFLP PCR  Ez de restricción GENOTIPO RFLP 

Micobacterias PCR-RFLP

RT-PCR MÚLTIPLE VIRUS RESPIRATORIOS

HIBRIDACIÓN REVERSA RLB

Inno-Lipa Micobacterias

Curva de amplificación PCR

Detección objetiva del amplicón Menor tamaño amplicones Real time PCR Ventajas No se hace corrida Detección objetiva del amplicón Más sensible Multiplex Más rápida Menor tamaño amplicones Cargas virales

Real time PCR

Curva de melting

Curva de melting

TaqMan probes

Molecular beacon probes

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DETECCIÓN MÉTODO DE AMPLIFICACIÓN EXTRACCIÓN DE ADN O ARN

Amplificación isotérmica Ej: Bayer Quantiplex – NASBA (HIV – HCV) Lectura por electroquimioluminiscencia

Branched DNA Quantiplex bDNA Signal Amplification System, de Chiron Corporation (VIH – VHC –VHB)

Hibridación de captura HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria

Secuenciación

Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.

DNA CHIP MICROARREGLOS DE DNA