LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALES WNT POR INHIBICIÓN EPIGENÉTICA DE SUS GENES REPRESORES SE ASOCIA AL PRONÓSTICO DE LA LMA

Vía Wnt  La vía de señalización Wnt es una de las rutas que comunica la membrana con el núcleo celular.  Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos en embriones.  Mecanismos de auto-renovación, diferenciación y proliferación de las células madre hematopoyéticas.  El genoma humano tiene al menos 20 genes que codifican para proteínas Wnt: glipoproteínas secretadas que regulan los procesos implicados en el desarrollo y son las que inician la cascada de señales.

ACTIVAINACTIVA Vía Wnt CICLINA D1 / C-Myc

Gen Enfermedad Referencia WNT1 Cáncer de mama murino Nurses & Varnus 1982 APC Cáncer de colon Polakis, 1997 AXINA-1 Carcinoma hepotocelular Clevers, 2000 Β-catenina Cáncer de colon y melanomas Su, 1993 & Rubinfeld 1993 LRP5 Defectos de la densidad ósea Boyden et al Axina 2 Formación de los dientes Lammi et al Vía Wnt La vía Wnt se puede encontrar desregulada por alteración de los componentes de la vía:

Vía Wnt La vía Wnt en LMA Constitutive activation of the Wnt/b-catenin signalling pathway in acute myeloid leukaemia. Simon et al. Oncogene Translocation products in acute myeloid leukemia activate the Wnt signalling pathway in hematopoietic cells. Müller-Tidow et al. Mol Cell Biology Flt3 tandem deplicarion mutations cooperate with Wnt signalling in leukemic signal transduction. Tickenbrock et al. Blood. 2006

FZD3 WNT16 TCF1/LEF1 Ciclina-D1 RT-PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL Hdpr1 PCR ESPECÍFICA DE METILACION CON ADN TRATADO CON BISULFITO Dkk 1, 2, 3, y 4 Wif1 Inhibidores / Activadores Wnt Román-Gómez et al. Blood 2007 Líneas celulares LLA Regulación epigenética de vía Wnt + Activación constitutiva de vía Wnt sFRPs 1,2,3,4 y 5 20 LLA + 32 LPA + 50 LMA Metilación Wif: factor pronostico independiente en LPA Chim et al. Leukemia 2006

Hipótesis La activación de la vía Wnt ocurre en muchos tipo de cáncer, siendo el cáncer de colon el mejor estudiado. Esta desregulación ocurre por la alteración de los componentes de la vía Wnt o sus genes antagonistas. En la LLA uno de los mecanismos que alteran los genes antagonistas de la vía Wnt es la metilación. En la LMA se ha demostrado que la vía Wnt se encuentra activada de forma constitutiva. Nos proponemos investigar si la metilación de algunos de los genes antagonistas es responsable en parte de esta activación.

Objetivos  Determinar si los genes represores-Wnt se inactivan por metilación en la LMA.  Determinar si dicha metilación activa la vía de señales Wnt.  Determinar el papel de la metilación en la patogénesis y pronóstico de la LMA.

Material y Métodos Pacientes  184  184 LMA al diagnóstico  110 hombres y 74 mujeres  Mediana de edad: 60 años (extremos 16 – 92)  Mediana de leucocitos: 9.4 x 10 9 /L (extremos 0.6 – 620)  Clasificación FAB: 14 M0; 45 M1; 48 M2; 26 M4; 27 M5; 18 M6; 2 M7; 4 Otros  164 casos citogenética valorable: 15 grupo riesgo citogenético FAVORABLE 111 grupo riesgo citogenético INTERMEDIO 38 grupo riesgo citogenético ADVERSO

Material y Métodos Modificación química del ADN NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico MSP-PCR Primers específicos metilación: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green 55ºC o/n Control negativo Control positivo Niveles de expresión Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green

Material y Métodos Sybr Green

Material y Métodos Modificación química del ADN NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico MSP-PCR Primers específicos metilación: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green 55ºC o/n Control negativo Control positivo Niveles de expresión Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green

Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA

Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA

Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA 64% La metilación aberrante es un evento frecuente en la LMA: el 64% de los pacientes presentan algún gen metilado

Resultados II. Sobre-expresión de los genes de la vía Wnt La sobre-expresión de genes de vía Wnt ocurre entre los pacientes con fenotipo metilador n=370 gen1-6 gen ↓ TCF1917 ↑ TCF1011 n=400 gen1-6 gen ↓ CD11022 ↑ CD108 n=310 gen1-6 gen ↓ LEF1518 ↑ LEF108 Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo metilador

Resultados III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt con las características clínico-biológicas de los pacientes sFRP1sFRP2sFRP4sFRP5DKK1DKK3 p valor FLT3ITD n.s NPM n.s EDAD n.s > < SEXO n.s Hombre Mujer LEUCOS n.s > < CITOGEN n.s Fav Int Adv Perfil 0.015

Resultados III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt con las características clínico-biológicas de los pacientes - + Perfil sFRP1sFRP2sFRP4sFRP5DKK1DKK RC (1º ciclo) RC (2º ciclo) RESISTENC MUERTE p valor n.s 0.03 n.s

Resultados Serie Total IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

Resultados Serie Total IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

Resultados 0.2 Serie Total IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

Resultados SG EDAD< FLT3-ITD0.1 NPM10.4 FLT3ITD + NPM10.06 SEXO0.6 LEUCOS > FAB0.5 RC1º / RC2º0.6 CITOGENETICA0.008 sFRP10.01 sFRP20.7 sFRP40.1 sFRP50.03 DKK10.8 DKK30.2 Serie Total IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

Resultados IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE SLE EDAD< FLT3-ITD0.03 NPM10.4 FLT3ITD + NPM10.01 SEXO0.2 LEUCOS > FAB0.5 RC1º / RC2º0.3 CITOGENETICA0.008 sFRP10.08 sFRP20.5 sFRP40.1 sFRP50.7 DKK10.6 DKK30.2 Serie Total

Resultados SLR EDAD 0.1 FLT3-ITD0.005 NPM10.3 FLT3ITD + NPM SEXO0.09 LEUCOS > FAB0.8 RC1º / RC2º0.5 CITOGENETICA0.1 sFRP10.08 sFRP20.4 sFRP40.8 sFRP50.7 DKK10.3 DKK30.3 Serie Total IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

Resultados SG: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA

Resultados IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA SLE: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio

Resultados IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA SLR: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio

Resultados Menor 60 años & Cariotipo Intermedio IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA

Resultados Menor 60 años & Cariotipo Intermedio IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA

Resultados Menor 60 años & Cariotipo Intermedio IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA

Conclusiones  Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA. El 64% de los pacientes presenta algún gen metilado.  Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo metilador.  La metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt se asocia a la activación de la Vía Wnt en pacientes con LMA.

Conclusiones  La metilación de los genes no se asoció a las características clínico-biológicas de los pacientes. Excepto sFRP5 que se asoció al grupo de riesgo citogenético adverso y a la resistencia tras la inducción.  El fenotipo metilador se asocia al subgrupo de mal pronóstico en los pacientes jóvenes pertenecientes al grupo de riesgo citogenético intermedio.  En el análisis univariante el gen sFRP5 se asocio a un mayor riesgo de recaída.

Próximos experimentos Estudio in vitro en 4 líneas celulares de LMA: KASUMI-1: FAB-M2; t (8;21) KG1A: FAB-M6 TPH1: FAB-M5; t (9;11) HL60: FAB-M2 (c-myc) AS METILACIÓN Y EXPRESIÓN DE GENES ANTAGONISTAS AZA EXPRESIÓN DE CD1, TCF1 Y LEF1