Staphylococcus aureus Vancomicina Resistente (VRSA) María Pérès Gustavo Lodovichi Residencia Htal. “Juan A. Fernández”

Staphylococcus aureus Agente etiológico de infecciones nosocomiales de la comunidad Infecciones post-Qx Neumonía Bacteriemia Infección de piel y partes blandas Endocarditis Osteomielitis Enfermedades por toxinas: Síndrome de la piel escaldada Síndrome del shock tóxico

Un poco de historia… 1943 ‘50 1959 ‘70 ‘80 ‘90 Introducción de la penicilina 1943 Desarrollo de resistencia a penicilina: PENICILINASAS ‘50 Introducción de ß-lactámicos semisintéticos 1959 Aparición de resistencia a ß-lactámicos semisintéticos ‘70 Expansión mundial de resistencia MRSA ‘80 uso de vancomicina para las infecciones por MRSA Desarrollo de resistencia a vancomicina 1996 - VISA 2002 - VRSA ‘90

Glicopéptidos (GP) VAN TEI VAN Vancomicina (VAN) se aisló de la fermentación de Amycolatopsis orientalis Teicoplanina (TEI) se aisló de la fermentación de Actinoplanes teichomyceticus Creados en 1956 VAN es utilizada ampliamente en el mundo TEI es utilizada en Europa y Latinoamérica, no en EEUU Espectro de actividad restringido a bacterias Gram (+)

Composición de la Pared Celular

Peptidoglicano de S.aureus Polímero de cadenas largas de glicanos entrecruzadas vía puentes de péptidos

Síntesis de pared celular Dipéptido D-Ala D-Ala Ligasa + ATP G M Tripéptido Residuos D-Ala + G M PARED CELULAR CITOPLASMA Membrana citoplasmática Pentapéptido M Crecimiento del peptidoglicano G

GP complejan al residuo D-Ala-D-Ala de los precursores del PG Mecanismo de acción de GP GP complejan al residuo D-Ala-D-Ala de los precursores del PG Bolsillo que encierra la región D-Ala-D-Ala D-Ala-D-Ala

Resistencia a Glicopéptidos

Factores de riesgo Enfermedad de base: IRC, HTA, DBT Edad: pacientes añosos más propensos Infección recurrente con S. aureus meticilino-resistente (MRSA) Tratamiento prolongado (6-18 semanas) con GP en los 3-6 meses previos a la infección Pacientes en diálisis peritoneal o hemodiálisis

Normas del CLSI (2002) Puntos de corte de GP en S. aureus Categorías CIM (µg/ml) VAN TEI VSSA ≤ 4 ≤8 VISA 8-16 16 VRSA ≥ 32 VSSA: S. aureus vancomicina sensible VISA: S. aureus vancomicina intermedio VRSA: S. aureus vancomicina resistente

Otras normas internacionales Organización VAN (µg/ml) S I R CLSI* ≤ 4 8-16 ≥ 32 CA-SFM** BSAC*** - ≥ 8 *CLSI, National Commitee for Clinical Laboratory **CA-SFM, Comité de l´Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie ***BSAC, British Society for Antimicrobial Chemotherapy

Normas del CLSI (2006) Puntos de corte de GP en S. aureus y en SCN ATB CIM (µg/ml) Comentarios S I R VAN M100-515 (2005) ≤ 4 8-16 ≥ 32 S.aureus/ SCN M100-516 (2006) ≤2 4-8 ≥ 16 S. aureus SCN

VISA CIMVAN= (8-16) µg/ml CIMVAN= 8µg/ml Japón 1996 1er VISA (Mu50) Infección por MRSA No portan los genes vanA ni vanB Forman agregados multicelulares en medio líquido Características fenotípicas atípicas Agar sangre incubado 24 hrs a 35 °C: Se observan las distintas morfologías de colonias - Cepa VISA de Michigan (CIM=8ug/ml)

Características de VISA Incorporación aumentada de NAG Pool aumentado de precursores (UDP-N-AC-muramilpentapéptido) Grado de reciclado de pared celular aumentado Producción aumentada de PBP2 Pared celular dos veces más gruesa Proporción aumentada de muropéptidos de Gln no amidada Liberación más lenta de materiales de pared celular

Mecanismo de resistencia propuesto para VISA Trampas de afinidad

Fotografía de TEM Cultivo de cepa MRSA en BHI libre de vancomicina Cultivo de la misma cepa en BHI con 8µg/ml de vancomicina

Hetero-VISA (h-VISA) Cepas sensibles a VAN (≤ 4 µg/ml), con subpoblaciones de µorgs con CIMVAN intermedio (≥ 4 µg/ml) CIM resultante = (1-4) µg/ml Japón 1996 CIMVAN= 4 µg/ml CIMVAN(subpob)= (5-9) µg/ml 1er h-VISA (Mu3) Pasajes sucesivos con concentración creciente de VAN Subpoblaciones con altos niveles de R VISA

Características de h-VISA Incorporación aumentada de NAG Pool aumentado de precursores (UDP-N-AC-muramilpentapéptido) Grado de reciclado de pared celular aumentado Producción aumentada de PBP2

Relación con MRSA Vancomicina ß-lactámicos VSSA h-VISA VISA J. Clin. Microb,2003,41:5-14

VRSA CIMVAN ≥ 32µg/ml Michigan CIMVAN= 1024 µg/ml 2002 1988 1er VRSA (MI-VRSA) Michigan 2002 CIMVAN= 1024 µg/ml 1988 1er E. faecium resistente a VAN en Francia Noble y col demostraron transferencia conjugativa in vitro desde una cepa de E. faecalis a una cepa de MRSA 1992

Constitutiva o inducible Fenotipos de resistencia a VAN en Enterococos Fenotipos vanA vanB vanC vanD vanE/G CIMVAN (µg/ml) 64->1000 4->1000 2-32 16-64 16 CIMTEI 16-512 ≤ 0.5 2-4 0.5 Modo de transmisión Inducible Constitutiva o inducible Localización predominante Plásmido Cromosom Determinante genético Adquirido Intrínseco Transferible Sí No Precursor alternativo D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser

Cluster VanA Regulación Resistencia a GP Genes accesorios van R van S van H van A van X van Y van Z

Membrana citoplasmática Mecanismo de resistencia Piruvato VanH Residuos D-Ala + D-Ala + D-Lac Ligasa + ATP VanX VanA ATP Dipéptido Depsipéptido G M Tripéptido CITOPLASMA G M Tripéptido G M Pentapéptido G M VanY Pentadepsipéptido Membrana citoplasmática Lipido transportador Crecimiento del peptidoglicano Acción del GP

Mecanismo de resistencia propuesto Cambio conformacional creado por D-Ala-D-Lac 1000 veces menos afinidad que D-Ala-D-Ala Pérdida de estabilidad del complejo con GP

Casos de VRSA Michigan, junio 2002 Pensilvania, septiembre 2002 New York, marzo 2004 Michigan, marzo 2005

Casos de VRSA CASOS MI-VRSA (I) PA-VRSA NY-VRSA MI-VRSA (II) + Sí - Edad (años) 40 74 63 78 Enfermedad de base DBT/IRC Obesidad/DBT DBT/IRC/IC MRSA presente + Tto. con VAN Sí - EVR presente Un año antes Portación nasal NEG ND

Métodos de detección

Métodos de detección Screening de VAN CIM por dilución en caldo CIM por ETEST

Screening de vancomicina Medio Agar BHI Concentración de ATB 6 μg/ml Inóculo 0.5 de Mc Farland. 10 μl en spot Condiciones de incubación 24 hs, 35 °C Resultados ≥ 1 colonia o crecimiento tenue Control de calidad E. faecalis ATCC 29212 E. faecalis ATCC 51299

Métodos de detección Screening de VAN CIM por dilución en caldo CIM por ETEST

CIM por dilución en caldo Medio Caldo Mueller-Hinton Inóculo 0.5 de Mc Farland Condiciones de incubación 24 horas, 35 ± 2 °C

Métodos de detección Screening de VAN CIM por dilución en caldo CIM por E-TEST

E-TEST Medio Agar Mueller Hinton Inóculo 0.5 de Mc Farland Condiciones de incubación 24 hs, 35 °C Resultados Considerar las microcolonias en la lectura

VISA Criterios del CDC Detección - Difusión - Screening de Vanco - ETEST - Dilución en caldo - Métodos automatizados

Criterios del CDC para VISA Crecimiento en la placa de screening de vancomicina CIM a VAN ≥ 6 μg/ml por E-TEST CIM de 8-16 μg/ml por dilución en caldo

Modificación CLSI 2006 CIMVAN (μg/ml) S I R ≤ 2 4-8 ≥ 16

…próxima redefinición de criterios VISA Crecimiento en la placa de screening de VAN CIM a VAN ≥ 3 μg/ml por ETEST CIM de 4-8 μg/ml por dilución en caldo

VISA Criterios del CDC Detección - Difusión - Screening de VAN - ETEST - Dilución en caldo - Métodos automatizados

Los VISA no se detectan por difusión Detección de VISA Los VISA no se detectan por difusión

VISA Criterios del CDC Detección - Difusión - Screening de Vanco - ETEST - Dilución en caldo - Métodos automatizados

VISA Criterios del CDC Detección - Difusión - Screening de Vanco - ETEST - Dilución en caldo - Métodos automatizados

Métodos automatizados Detección de VISA Métodos automatizados Vitek Microscan

h-VISA Criterios del CDC Detección - Análisis poblacional - Análisis poblacional simplificado - Macro ETEST - CIM

Criterios del CDC para h-VISA CIM a VAN ≤ 4 μg/ml Subpoblaciones de células resistentes a altas concentraciones de VAN Mutantes resistentes (CIM ≥ 8 μg/ml), seleccionadas en un solo paso a una frecuencia ≥ 10-6

h-VISA Criterios del CDC Detección - Análisis poblacional - Análisis poblacional simplificado - Macro ETEST - CIM

Análisis poblacional Concentraciones crecientes de VAN Inóculo : 108 UFC/ml Concentraciones crecientes de VAN Incubación a 37 °C durante 48 horas Recuento de colonias

Antimicrob. Agents Chemother,2003, 47.10:3040-3045 Análisis poblacional Antimicrob. Agents Chemother,2003, 47.10:3040-3045

h-VISA Criterios del CDC Detección - Análisis poblacional - Análisis poblacional simplificado - Macro ETEST - CIM

Análisis poblacional simplificado Suspensión Bacteriana más alta Inóculo: 108 UFC/ml 100 µl 10 µl BHI con 4 µg/ml de VAN Agar MH Crecimiento 48 hs Incubación a 35 °C Crecimiento 24 hs Pasaje medio con VAN Confirmación VISA Confirmación h-VISA

h-VISA Criterios del CDC Detección - Análisis poblacional - Análisis poblacional simplificado - Macro ETEST - CIM

Macro ETEST Inóculo: 200 µl 2.0 McFarland Agar BHI Sensibilidad 93% - Especificidad 97% J. Clin. Microb,2001,39:2439-2444

h-VISA Criterios del CDC Detección - Análisis poblacional - Análisis poblacional simplificado - Macro ETEST - CIM

VRSA Criterios del CDC Detección - Screening de Vanco - ETEST - Dilución en caldo - Métodos automatizados

Criterio para VRSA CIMVAN ≥ 32 μg/ml por dilución en caldo

VRSA Criterios del CDC Detección - Screening de VAN - ETEST - Dilución en caldo - Métodos automatizados

Screening de vancomicina Recomendada en caso de que se utilicen solo métodos automatizados Podría utilizarse para exaltar la sensibilidad en la detección

VRSA Criterios del CDC Detección - Screening de VAN - ETEST - Dilución en caldo - Métodos automatizados

Detección de VRSA Método por dilución en caldo Método de difusión por ETEST Tiene la ventaja de mostrar crecimiento de colonias Método por dilución en caldo Es el único método validado por el CLSI

VRSA Criterios del CDC Detección - Screening de VAN - ETEST - Dilución en caldo - Métodos automatizados

Métodos automatizados Detección de VRSA Métodos automatizados Los métodos automatizados fallaron cuando se los usó para detectar las cepas con un bajo nivel de resistencia

Casos de VRSA Michigan I Pensilvania Nueva York Michigan II CIM (µg/ml) 1024 32 64 256 ¿EVR presente? Si No Un año antes ¿Detección por autoanalizador? SI Microscan: sí VITEK 2: no Detección con screening de Vanco (6 µg/ml) PCR vanA Tn1546 (vanA)

Tratamiento No hay terapia estandarizada Remoción de catéteres infectados, y limpieza de los sitios infectados Experiencia terapéutica en aislamientos VISA Experiencia terapéutica en aislamientos VRSA Fallas de tratamiento con vancomicina asociadas a hVISA

Sinergia entre VAN y β-lact contra cepas VISA Combinación oxacilina-vancomicina Asociación directa con el nivel de resistencia a vancomicina Relación de la sinergia con la especificidad de sustrato de la PBP2a Competencia por los componentes monoméricos Antimicrob. Agents Chemother,1999, 43.7:1747-1753

Recomendaciones para control de infecciones Prevención de la diseminación Aislamiento del paciente Batas y guantes Barbijo y protección ocular Limpieza de manos No intercambiar equipos entre los pacientes Continuar los cultivos Minimizar el personal dedicado a cada paciente Educación del personal

Evaluación de la diseminación Cultivos basales de manos y fosas nasales Cultivos basales de otros contactos Cultivos semanales

Decolonización Reducir o erradicar la carga bacteriana Se basa en: el estado inmune del individuo, la tolerancia a la droga, el riesgo de transmisión a otros El CDC no recomienda la decolonización Mupirocina (sola o combinada con rifampicina oral, clorhexidina y bacitracina)

Screening de VAN en placas no comerciales n = 36 (MRSA y SCN resistentes a meticilina) 0.5 Mc Farland 10 µl 4 µg/ml 5 µg/ml 6 µg/ml 35 cepas no desarrollaron 1 cepa desarrolló en la placa de 5 µg/ml ETESTVAN = 2 µg/ml (S) ETESTTEI = 1 µg/ml (S) CIMVAN = 1 µg/ml (S)

Conclusiones

Evitar el uso indiscriminado de vancomicina Por el momento, no es necesario realizar el screening de VAN a todos los MRSA, ya que no es costo efectivo Vigilar a los pacientes con factores de riesgo Tener precaución cuando se usan métodos automatizados solos Surge la necesidad de nuevos antibióticos que sean efectivos contra MRSA, VISA y VRSA.

AGRADECIMIENTOS Dra Sara Kaufman. Jefa de Microbiología, Laboratorio Htal J. A. Fernández. Dra. Laura Errecalde. Sección Antibiogramas, Laboratorio Htal J. A. Fernández. Dra. Alejandra Corso. Servicio de Antimicrobianos, INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.

Gracias por su atención