PulseNet América Latina 4ta Reunión Internacional Buenos Aires, 22 y 23 de junio 2006 Mariana Pichel Servicio Enterobacterias – Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Carlos G. Malbrán” 22 de junio de 2006 “Subtipificación de Enterobacter sakazakii por PFGE” Red de Subtipificación Molecular para Vigilancia de Enfermedades Transmitidas por los Alimentos

Enterobacter sakazakii Asociado a infecciones infantiles graves, especialmente en lactantes: sepsis, meningitis y enterocolitis necrotizante (NEC). Alta tasa de mortalidad. Asociado a infecciones infantiles graves, especialmente en lactantes: sepsis, meningitis y enterocolitis necrotizante (NEC). Alta tasa de mortalidad. Reservorio desconocido. Muy resistente a la falta de humedad y a altas temperaturas Reservorio desconocido. Muy resistente a la falta de humedad y a altas temperaturas Preparados en polvo para lactantes han sido asociados como fuente de infección en los casos de infección en neonatos. Preparados en polvo para lactantes han sido asociados como fuente de infección en los casos de infección en neonatos.

Antecedentes epidemiológicos USA, Tennesse, 4 lactantes afectados. (Simmons et al. Infect. Control Hosp Epid 1989;10: ). USA, Tennesse, 4 lactantes afectados. (Simmons et al. Infect. Control Hosp Epid 1989;10: ). Islandia, 3 neonatos, 2 con secuelas neurológicas, 1 fallecido. (Biering el al, JCM 1989; 27 (9): Islandia, 3 neonatos, 2 con secuelas neurológicas, 1 fallecido. (Biering el al, JCM 1989; 27 (9): Holanda, 8 casos de meningitis en neonatos en 6 años, dos con NEC, mortalidad:75%. (Muytjens et al, JCM 2001; 39: ) Holanda, 8 casos de meningitis en neonatos en 6 años, dos con NEC, mortalidad:75%. (Muytjens et al, JCM 2001; 39: ) En todos estos casos se recuperó el microorganismo en las fórmulas utilizadas para alimentar a los afectados. Bélgica, 12 lactantes con NEC, 2 fatales. (Van Acker et al., JCM 2001;39:293-97). Se recuperó E. sakazakii en muestras clínicas, a partir de la fórmula infantil en polvo consumida y en envases cerrados del mismo lote. Se estableció similitud entre los aislamientos por AP-PCR. Bélgica, 12 lactantes con NEC, 2 fatales. (Van Acker et al., JCM 2001;39:293-97). Se recuperó E. sakazakii en muestras clínicas, a partir de la fórmula infantil en polvo consumida y en envases cerrados del mismo lote. Se estableció similitud entre los aislamientos por AP-PCR.

E. sakazakii Incluido desde febrero del 2004 en la categoría A (Pruebas clara de causalidad) de la lista de patógenos de riesgo de la FAO/OMS, para microorganismos relacionados con preparados en polvo para lactantes junto con Salmonella spp.

Se evaluaron dos protocolos para la subtipificación de E. sakazakii: Se evaluaron dos protocolos para la subtipificación de E. sakazakii:  A) Protocolo estandarizado de la Red PulseNet para Shigella sonnei  B) Protocolo desarrollado en el laboratorio del Dr. Matthew J. Arduino, Epidemiology and Laboratory Branch Division of Healthcare Quality Promotion, Centers for Disease Control and Prevention, USA PFGE para la subtipificación de Enterobacter sakazakii

Protocolo A Protocolo B Preparación de plugs de agarosa cc. bacteriana ajustada por turbidimetría Preparación de plugs de agarosa cc. bacteriana estimada (200 a 250 ul de cultivo O.N.) Lisis 2 hs. a 55ºC en buffer +Proteinasa K (PK) (Sarcosyl/Tris/EDTA/PK) Lisis en dos pasos: - 4 hs. a O.N. a 37ºC en buffer+lisozima (Sarcosyl/EDTA/Desoxicolato de sodio/Lisozima) - O.N. a 55ºC en buffer+PK (Laurilsarcosina/EDTA/PK) Lavados 2 con agua y 4 con TE Lavados al menos 3 con TE Digestión con enzima XbaI (30 U, 18hs) Digestión con enzima SpeI (20 U, 18hs) Electroforesis: 2.2 a 54.2 seg, 6 volts/cm, 18 hs. Electroforesis: 5.3 a 38.6 seg, 6 volts/cm, 16 hs.

PFGE para aislamientos de E. sakazakii Protocolo A Enzima de restricción: XbaI 1: PulseNet Std Strain CDC # H9812 2: E. sak cepa #1 3: E. sak cepa # 2 4: E. sak cepa # 3 5: PulseNet Std Strain CDC # H9812 6: E. sak cepa # 4 7: E. sak cepa # 5 8: E. sak cepa # 6 9: E. sak cepa # 7 10: PulseNet Std Strain CDC # H

Dendograma de relación genética de aislamientos de E. sakazakii realizado con el programa BioNumerics versión 4.0 con los parámetros de PulseNet (Coeficiente de Dice, optimización 1.5%, tolerancia en la posición de las bandas 1.5%). PFGE para aislamientos de E. sakazakii Protocolo A

1: PulseNet Std Strain CDC # H9812 2: E. sak cepa #1 3: E. sak cepa # 2 4: E. sak cepa # 3 5: PulseNet Std Strain CDC # H9812 6: E. sak cepa # 4 7: E. sak cepa # 5 8: E. sak cepa # 6 9: E. sak cepa # 7 10: PulseNet Std Strain CDC # H9812 PFGE para aislamientos de E. sakazakii Protocolo B Enzima de restricción: SpeI

Dendograma de relación genética de aislamientos de E. sakazakii realizado con el programa BioNumerics versión 4.0 con los parámetros de PulseNet (Coeficiente de Dice, optimización 1.5%, tolerancia en la posición de las bandas 1.5%). PFGE para aislamientos de E. sakazakii Protocolo B

Conclusiones Ambos protocolos permiten obtener geles de PFGE de alta calidad, con un número adecuado de bandas bien distribuidas en cada perfil Ambos protocolos permiten obtener geles de PFGE de alta calidad, con un número adecuado de bandas bien distribuidas en cada perfil El protocolo A presenta las siguientes ventajas: El protocolo A presenta las siguientes ventajas: - Es más rápido (una sola incubación en buffer de lisis) - Es más económico (no requiere lisozima y la enzima XbaI es más económica que SpeI) - Hay menor probabilidad de contaminación al partir de un cultivo en placa y no de caldo

Estudio de aislamientos de E. sakazakii de fórmulas lácteas en polvo Se analizaron 21 aislamientos de E. sakazakii recuperados de fórmulas lácteas infantiles en polvo, correspondientes a dos marcas diferentes, ambas importadas y comercializadas en la ciudad de Buenos Aires: Se analizaron 21 aislamientos de E. sakazakii recuperados de fórmulas lácteas infantiles en polvo, correspondientes a dos marcas diferentes, ambas importadas y comercializadas en la ciudad de Buenos Aires:  Marca A: 20 aislamientos lote 1 (n=16), lote 2 (n=1), lote 3 (n=1), lote 4 (n=1), lote 5 (n=1)  Marca B: 1 aislamiento

Brand A, batch 1 Brand A, batch 2 Brand A, batch 1 Brand A, batch 3 Brand A, batch 1 Brand B Brand A, batch 1 Brand A, batch 4 Brand A, batch 1 Brand A, batch 5 Análisis por PFGE de E. sakazakii Se aplicó el protocolo A con la enzima XbaI Se aplicó el protocolo A con la enzima XbaI

Conclusiones Primeros aislamientos de E. sakazakii en fórmulas lácteas en Argentina y primer estudio de diversidad genética por PFGE. Primeros aislamientos de E. sakazakii en fórmulas lácteas en Argentina y primer estudio de diversidad genética por PFGE. La relación genética entre los aislamientos de E. sakazakii de dos marcas diferentes de PIF evidencia la necesidad de realizar una investigación sobre estos productos, a fin de identificar las fuentes de contaminación de los mismos. La relación genética entre los aislamientos de E. sakazakii de dos marcas diferentes de PIF evidencia la necesidad de realizar una investigación sobre estos productos, a fin de identificar las fuentes de contaminación de los mismos. La presencia de diferentes subtipos genéticos en distintos lotes y aún dentro de un mismo lote de PIF de una misma marca sugieren la existencia de diferentes fuentes de contaminación. La presencia de diferentes subtipos genéticos en distintos lotes y aún dentro de un mismo lote de PIF de una misma marca sugieren la existencia de diferentes fuentes de contaminación. Es necesario profundizar el estudio de E. sakazakii como agente causal de ETA e implementar un protocolo estandarizado de PFGE que permita crear una Base de Datos, con el fin de conocer y comparar los subtipos circulantes en distintas regiones. Es necesario profundizar el estudio de E. sakazakii como agente causal de ETA e implementar un protocolo estandarizado de PFGE que permita crear una Base de Datos, con el fin de conocer y comparar los subtipos circulantes en distintas regiones.

Participantes del estudio DIRECCION GENERAL DE HIGIENE Y SEGURIDAD ALIMENTARIA, GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES: DIRECCION GENERAL DE HIGIENE Y SEGURIDAD ALIMENTARIA, GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES: Sergio Epszteyn Celia Melamed Edith Marey Mariana Motter María Eugenia Ferrer Santiago Mingorace Silvana Sanchez INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”: INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”: Raquel Terragno Norma Binsztein Angela Salve María Inés Caffer Salomé Vilchez Larrea Agradecemos la colaboración de Raquel Callejo y Mónica Prieto

GRACIAS!!!!!!!!