DNA RECOMBINANTE E INGIENIERÍA GENÉTICA
INGENIERÍA GENÉTICA MANIPULACIÓN DEL DNA DE LOS ORGANISMOS VIVOS 1) INVESTIGACIÓN BÁSICA (ESTUDIO DE LA ORGANIZACIÓN, EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE GENES EN LOS ORGANISMOS VIVOS). 2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓN CONSCIENTE DE LOS GENES EN SALUD, EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS, EN LA AGRICULTURA, ETC.
PIEDRAS ANGULARES DE LA INGIENIERÍA GENÉTICA CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNA Y GENÓMICAS DESCUBRIMEINTO DE LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (ENZIMAS DE RESTRICCIÓN) DESCUBRIMIENTO DE LA REACCIÓN DE POLIMERIZACIÓN DE CADENA O PCR (POLYMERASE CHAIN REACCTION)
Técnicas de DNA Recombinante
El problema: ¿Qué material genético vamos a manipular y cómo lo vamos a hacer?
ANALISIS DE GENES TECNICAS Obtener múltiples copias de ellos Aislar secuencias de DNA Obtener múltiples copias de ellos TECNICAS Clonamiento Molecular PCR (reacción en cadena de la polimerasa) Se requiere:
CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped *
Enzimas de Restricción
DIGESTION DEL DNA POR ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Sitio de corte
Sitios de corte de endonucleasas de restricción Sitio de corte de enzimas de restricción Sitios de corte de endonucleasas de restricción ES ENZIMAS de RESTRICCION Las flechas indican los enlaces fosfodiester sobre los que actúa cada enzima
CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped
Características básicas de un vector de clonamiento Origen de replicación autónomo Gen marcador de selección Sitios únicos de restricción
Caja de clonaje múltiple Componentes básicos de un vector de clonamiento plasmidial que puede replicar en una célula de E.coli codifica proteína de resistencia a ampicilina Región de inserción de DNA Exógeno Origen de replicación Caja de clonaje múltiple
¿PORQUE EL USO DE UN VECTOR ? 1ª división celular 2ª división celular
TIPOS DE VECTORES kpb Plasmidios 3-5 bacteriofagos 15 BACS 300 inserto Plasmidios 3-5 bacteriofagos 15 BACS 300 YACS 2000
CLONAMIENTO EN PLASMIDIO EcoRI PvuII Sitio de corte Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII
CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped
Fragmentos de DNA genómico Unión de fragmentos de restricción que poseen extremos cohesivos Fragmentos de DNA genómico b + c
CLONAMIENTO EN PLASMIDIO EcoRI PvuII Sitio de corte Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII
CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped
PROPAGACION EN CELULA HUESPED
RESUMEN DE CLONAMIENTO Enzimas de restricción DNA Ligasa Vector Célula huésped
CLONES que contienen diferentes fragmentos del genoma = GENOTECA
GENOTECAS O LIBRERÍAS CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNA Y DE DNA GENÓMICO USO DE VECTORES -PLASMIDIOS -DNAs DE FAGOS -OTROS (BACs, COSMIDIOS, YACs, ETC).
Genoteca de cDNA Obtención : Clonamiento de cDNA obtenido mediante transcripción reversa de mRNA total.
vectores + ligación transformación
Genoteca de DNA genómico Obtención : 1. Fragmentación de todo el genoma mediante enzimas de restricción 2. Clonamiento de fragmentos en vectores
¿Cómo aislar un fragmento de DNA de interés? Aislamiento de un clon -Uso de sondas radiactivas - PCR
HIBRIDIZACION CON SONDAS MARCADAS Identificación de un fragmento de DNA específico en las colonias transformadas mediante HIBRIDIZACION CON SONDAS MARCADAS
Clonamiento por PCR
CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR libreria CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR
Combinación de la transcripción reversa con PCR RT-PCR
Cloning by RT-PCR TTTTTTT PCR cDNA Corte con enzimas de restricción y ligación a un plasmidio
CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR libreria CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR
SECUENCIACION DEL DNA
Estudio de la función de un gen Vectores de expresión
Vector de expresión en bacterias
Vectores de expresión en eucariotes
FUNCIÓN DE UN GEN Herramientas de Estudio: Análisis computacional en banco de datos: homología de secuencia con un gen de otro organismo cuya función se conoce. Animales transgénicos y knock out.