PRACTICA 1: Método de cuenta total estándar de microorganismos mesófilos aerobios en alimentos y método del numero mas probable para el análisis de coliformes fecales en alimentos. Mauricio Sánchez Lecuona Zamora Núñez Francisco Omar Flores Sandra Mejia

PROCEDIMIENTO 1. Pesar 10 g de alimento (en condiciones asépticas), añadir 90 ml de solución salina y licuar por un minuto ( alimentos sólidos) 2. Pesar 10 g de alimento (en condiciones asépticas), añadir 90 ml de solución salina y licuar por un minuto ( alimentos semi-sólidos o líquidos)

3. Seguir haciendo diluciones colocando 1 ml de la solución anterior con 9 ml de solución salina sucesivamente (10-2, 10-3, etc.) 4. Inocular 0.1 ml de cada dilución sobre placas de Agar cuenta estándar e incubar. 5. Posteriormente, inoclurar una serie de tres tubos con 10 ml de caldo lauril y 1 ml de solución correspondiente a las tres primeras diluciones hechas anteriormente. Dejar incubar y observar resultados.

6. De los tubos anteriores, observar los que dan positivos en la prueba de caldo Lauril y pasar de dos a tres asadas de cultivos con 10 ml de Caldo EC. Dejar incubar. 7. Sembrar dos placas de medio EMB y RVB apartir de los tubos positivos con medio EC.

8. Seleccionar colonias de las placas de medio EMB y RBV y sembrarlas en Agar SIM, Agar Citrato de Simmons y Caldo RM-VP 9. Realizar la prueba de Indol con el reactivo de Kovac para el Agar Sim y la de Vogues-Proskauer para el Caldo RM-VP. Observar los resultados.

Agar cuenta estándar (Agar triptona-extracto de levadura) Este medio de cultivo es el de uso mas generalizado. Se utiliza principalmente para el aislamiento e identificación y cuenta de coliformes

CALDO LAURIL SULFATO Medio selectivo recomendado para la detección y recuento de coniformes en aguas, aguas residuales y alimentos. Considerar como positivos aquellos tubos que presentan gas.

Fórmula (en gramos por litro) CALDO LAURIL SULFATO Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones   Triptosa 20.0 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Lactosa 5.0 Cloruro de sodio   Lauril sulfato de sodio 0.1   Fosfato dipotásico 2.75   Fosfato monopotásico pH final: 6.8 ± 0.2

Caldo EC Medio de cultivo para coliformes y E.coli en aguas, alimentos y otros materiales. La lactosa es la fuente de energía para los microorganismos, especialmente coliformes y E.coli con producción de gas. Las sales biliares inhiben el crecimiento de Gram.-positivos. La peptona de caseína proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de las bacterias y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. Se consideran resultados positivos el crecimiento bacteriano y producción de gas.

AGAR EMB (EOSINA AZUL DE METILENO) Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enteró bacterias. La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe el desarrollo de microorganismos Gram. positivos y de bacterias Gram. negativas y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras.

Fórmula (en gramos por litro) Peptona10.0 Lactosa10.0 Fosfato dipotásico2.0 Agar15.0 Eosina0.4 Azul de metileno0.065

EMB (+)

AGAR ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA-BILIS RVB Agar selectivo propuesto por DAVIS (1951) para la detección y la enumeración de las bacterias del coliform incluyendo E. coli en agua, leche, helado, carne y otros comestibles. Medio de color púrpura-rojizo

Fórmula (en gramos por litro) AGAR RVB Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de levadura 3.0 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45°C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.   Peptona 7.0 Sales biliares 1.5 Lactosa 10.0 Cloruro de sodio 5.0   Agar 15.0   Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.002 pH final: 7.4 ± 0.2

RESULTADOS Microorganismos Colonias Enterobacterias fermentadoras de lactosa Rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con halo de precipitación rojizo Enterobacterias no fermentadoras de lactosa Incoloras Enterococcus spp. Rosadas como punta de alfiler (puntiformes)

AGAR SULFURO INDOL MOVILIDAD SIM Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. Es de color ámbar.

AGAR SULFURO INDOL MOVILIDAD Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical. Peptona 6.1 Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio Agar 3.5 pH final: 7.3 ± 0.2

RESULTADOS Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.

Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

AGAR CITRATO DE SIMMONS Contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente Azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color de verde a azul.

Fórmula (en gramos por litro) Citrato de sodio 2.0 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato di potásico 1.0 Fosfato monoamónico 1.0 Sulfato de magnesio 0.2 Azul de bromotimol l0.08 Agar 15.0

CALDO RM-VP Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Es particularmente útil para la clasificación de enteró bacterias.

Fórmula (en gramos por litro) CALDO RM-VP Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos. Glucosa 5.0 Fosfato dipotásico pH final: 6.9 ± 0.2

REVELADO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS Prueba del rojo de metilo: Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio. Prueba del Voges Proskauer: Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.

RESULTADOS Prueba del rojo de metilo: Positivo: color rojo. Negativo: color amarillo Prueba de Voges Proskauer: Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del tubo. Negativo: ausencia de color rojo.