Tema: 13 CINÉTICA ENZIMÁTICA : REACCIONES REVERSIBLES Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten: Ecuación de velocidad reversible 2. Relación de Haldane 3. Validez de la asunción del estado estacionario

E + S === ES --------- E + P k-1 1. Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten Hasta ahora, en todos los modelos cinéticos estudiados, hemos considerado que la última reacción era irreversible, ….. k1 k2 E + S === ES --------- E + P k-1 …… sin embargo, esta última reacción también puede ser reversible, y de hecho en la mayoría de las reacciones bioquímicas lo es.

E + S === ES === E + P k-1 k-2 Ecuación de velocidad para reacciones reversible Es evidente que el mecanismo de Michaelis-Menten, tal y como lo hemos venido usando, es incompleto, y que debemos considerar también la reversibilidad de la última reacción. Con lo que el nuevo modelo tendrá la siguiente forma. k1 k2 E + S === ES === E + P k-1 k-2

y considerando condiciones de estado estacionario, tendremos: k1 k2 E + S === ES === E + P k-1 k-2 d(ES)/dt = k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] y considerando condiciones de estado estacionario, tendremos: d(ES)/dt = 0 Luego, k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] = 0

d[ES]/dt = k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] = 0 Intenten despejar [ES] Recuerden: [E] = [Eo] – [ES] k1([Eo] – [ES])[S] + k-2([Eo] – [ES])[P] – (k2 + k-1)[ES] = 0 k1[Eo][S] – k1[ES][S] + k-2[Eo][P] – k-2[ES][P] = (k2 + k-1)[ES] k1[Eo][S] + k-2[Eo][P] = (k1[S] + k-2[P])[ES] + (k2 + k-1)[ES] (k1[S] + k-2[P])[Eo] = (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)[ES] Despejando [ES],

E + S ES E + P k-1 k-2 v = k2[ES] – k-2[E][P] Como se trata de una reacción reversible, la velocidad neta a la que se forma el producto, P, será igual a la velocidad en el sentido directo () menos la velocidad en el sentido inverso (): k1 k2 E + S ES E + P k-1 k-2 v = k2[ES] – k-2[E][P]

Sustituyendo el valor de [ES]: Sumando estas fracciones, y poniendo denominador común, obtenemos un numerador que una vez simplificado conduce a la siguiente expresión:

(dividir numerador y denominador por k1). En el caso particular en el que [P] = 0, k1k2[Eo][S] – k-1k-2[Eo][P] v = ------------------------------------------ (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1) ¿Les recuerda esta ec. alguna otra? (dividir numerador y denominador por k1). Ecuación exactamente igual a la obtenida con la aproximación del estado estacionario de Brigg y Haldane.

Si bien, con pleno rigor, [S] debería sustituirse por [So] ya que para [P] = 0, la [S] = [So] NOTA: Es importante tener en cuenta que esta simplificación es posible porque [P] = 0, y no porque hayamos hecho asunción alguna sobre k-2, ya que k-2[P] = 0 si [P] = 0, independientemente del valor de k-2. ¿Qué forma tomara la ecuación de velocidad (reversible) cuando [S] = 0? .

dividir numerador y denominador por k-2 En el caso particular en el que [S] = 0, k1k2[Eo][S] – k-1k-2[Eo][P] v = ------------------------------------------ (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1) dividir numerador y denominador por k-2 Kmp Ecuación exactamente igual a la obtenida con la aproximación del estado estacionario de Brigg y Haldane.

* La anterior ecuación … la “ecuación reversible general” de la ecuación de velocidad de Michaelis-Menten. Esta ecuación, respecto de las anteriores, presenta la ventaja de que no se refiere a ningún tipo de mecanismo concreto, y puede considerarse como puramente empírica. De hecho existen mecanismos cinéticos mucho más complejos que los que hemos considerado hasta ahora, y que conducen a ecuaciones totalmente equivalentes a la que hemos obtenido más arriba.

2. Relación de Haldane Cuando una reacción química está en equilibrio, la velocidad de reacción neta es cero, ya que la velocidad de formación () es igual a la velocidad de descomposición (), y así, si denominamos [Seq] y [Peq] a las concentraciones del S y del P en el equilibrio, sustituyendo en la “ecuación reversible general”: Para que esta ec. sea = 0 basta con que:

(k1k2[Eo][Seq] – k-1k-2 [Eo][Peq]) = 0 reordenando, obtenemos, (k1k2[Eo][Seq] = k-1k-2 [Eo][Peq]) k1k2/k-1k-2 = [Eo][Peq]/[Eo][Seq] k1k2/k-1k-2 = [Peq]/[Seq] kcat k1k2 --------- k-1k-2 k-1k2 --------- k-1k2 KmP = 1 x --------- KmS k2 x ------ k-1 k-cat

kespecif./k-especif. = Keq k1k2 --------- k-1k-2 k-1k2 --------- k-1k2 KmP = --------- 1 x --------- KmS k2 x ------ k-1 kcat k-cat Luego, k1k2/k-1k-2 = (kcat KmP)/(k-cat KmS) = [Peq]/ [Seq] = Keq kcat KmP ---------------- = kespecif. x 1/k-especif. =[Peq]/ [Seq] = Keq KmS k-cat kespecif./k-especif. = Keq

Relación, muy importante en la cinética enzimática y que se conoce como relación de Haldane. Permite conocer la constante de equilibrio de la reacción a partir de constantes cinéticas * Esta relación es válida para cualquier mecanismo reversible y que contemple la formación de un sólo complejo intermedio. * Para mecanismos más complejos, que contemplen la formación de más de un complejo intermedio se obtienen relaciones más complejas pero similares.

Relación de Haldane. - La relación de Haldane nos permite obtener la constante de equilibrio, Keq, de la reacción a partir de las constantes cinéticas . Y por extensión, podemos, también calcular el valor de G’º de la reacción a partir de las constantes cinéticas enzimáticas, ya que: G’º = -RT ln Keq Las constantes cinéticas son fáciles de calcular experimentalmente.

3. Validez de la asunción del estado estacionario En la deducción de la ecuación de Michaelis-Menten, hemos supuesto que se “alcanzaba un estado estacionario”, en el que d[ES]/dt = 0. NO ¿Lo aceptamos tal cual? k1 k2 E + S === ES --------- E + P k-1 La ecuación: d[ES]/dt = k1([Eo] – [ES])[S] – k-1[ES] – k2[ES] es integrable por sí, si consideramos que [S] es constante.

d[ES]/k1[Eo][S] – (k1[S] + k-1 + k2)[ES] = dt NOTA: es instructivo intentar obtener una ecuación de velocidad bajo estas condiciones, es decir, sin admitir la existencia de un estado estacionario, sobre todo porque esto nos ayudará a entender la validez de esta asunción. d[ES]/k1[Eo][S] – (k1[S] + k-1 + k2)[ES] = dt Resolviendo, obtenemos, Calculando el valor de la constante

, que simplificando y reordenando nos da

Operando y tomando exponenciales a ambos lados, tendremos, y resolviendo para [ES], - ((k1[S] + k-1 + k2)[ES]/(k1[Eo][S])) = -1 + e– (k1[S] + k-1 + k2)t ((k1[S] + k-1 + k2)[ES]/(k1[Eo][S])) = 1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t (k1[S] + k-1 + k2)[ES] = (k1[Eo][S]) (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)

v = ---------------------------------------------- La velocidad de reacción, como sabemos, viene dada por. v= k2[ES] - Sustituyendo, v = k2[Eo] ((k1[S]) (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t))/(k1[S] + k-1 + k2) Y dividiendo por k1 numerador y denominador, k2[Eo] ([S] (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)) v = ---------------------------------------------- [S] + (k-1 + k2)/ k1) Vmax Km

v = ---------------------------------------------- [S] + Km Luego, = 0 Vmax ([S] (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)) v = ---------------------------------------------- [S] + Km ¿Qué hará falta para que esta ecuación sea igual a la que obtuvimos a partir de la presunción de estado estacionario? Cuando en esta ecuación, t se hace muy grande (t -> ), el término exponencial tiende a e-, es decir a cero, y la ecuación anterior se transforma en una ecuación exactamente igual a la de Michaelis-Menten. Ahora bien, el que el término exponencial pueda llegar a ser despreciable dependerá también en gran parte del valor de (k1(S) + k-1 + k2), así pues,desde un punto de vista real, ¿cuánto tiene que vale t para que esto se cumpla?

El término exponencial tiene un valor < 0,01 Un sencillo calculo, demuestra que para valores de t > 5 ms (5 10-3 s) El término exponencial tiene un valor < 0,01 Veámoslo, Si admitimos para (k1(S) + k-1 + k2) un valor de 1000 s-1, valor por otro lado razonable desde un punto de vista práctico, obtendremos: para t =4 ms -> e-4 = 0,018 para t = 5ms -> e-5 = 0.007 * En otras palabras, tras unos pocos de milisegundos, ambas ecuaciones son prácticamente indistinguibles desde un punto de vista práctico.

En la deducción de esta última ecuación hemos supuesto que la [S] era constante, lo que no es totalmente cierto, pues al comenzar la reacción S comienza a consumirse. Sin embargo, si partimos de una situación en la que [S] >> [Eo], como generalmente hacemos cuando trabajamos en condiciones de estado estacionario, la cantidad de S consumido durante el tiempo en que tarda en alcanzarse el estado estacionario, es insignificante, por lo que podemos despreciarlo sin miedo alguno a cometer o introducir algún error o inexactitud.

RESUMEN Con la condición de estado estacionario se pueden obtener una ecuación cinética que describe los procesos enzimáticos reversibles Se convierte en una ecuación cinética irreversible cuando se utilizan concentraciones de Productos igual a cero Relación de Haldane Permite conocer la constante de equilibrio de la reacción a partir de constantes cinéticas Esta relación es válida para cualquier mecanismo reversible y que contemple la formación de un sólo complejo intermedio Se ha demostrado la validez del modelo del sistema estacionario