LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Dra Susana Elgueta Miranda

RESPUESTA INMUNE El sistema inmunológico está programado para: Diferenciar entre lo propio y lo extraño Defensa contra agentes externos Las Moléculas responsables de estos eventos, pertenecen al MHC

LEUCOCITOS PASAJEROS

ALORECONOCIMIENTO RESPUESTA MUY VIGOROSA. 1-10% DE LT RESPONDEN A ALOANTIGENO CLONES RESTRINGIDOS POR MHC PRESENTAN ALOREACTIVIDAD PORCION TCR INVOLUCRADO EN RECONOCIMIENTO DE Ag+AUTOMHC RECONOCE ALOANTIGENO

RESPUESTA A ALOANTIGENOS GRAN EXPRESION MOLECULAS CMH, RECONOCIMIENTO DIRECTO POR REACCION CRUZADA, ESTIMULA CLONES DE BAJA Y ALTA AFINIDAD RESPUESTA POLICLONAL Y POLIESPECIFICA

FUNCIONES LABORATORIO ISP Laboratorio Nacional y de Referencia: *Estudio de histocompatibilidad a Receptores (potenciales) y Donantes *Asignación de riñón de donante cadáver *Tipificación HLA en enfermedades: B27, DR Lleva la Lista Nacional de Receptores de Organos (en espera y trasplantados) Otros: PEEC B27, Capacitación etc

BARRERAS ANTIGENICAS EN TRASPLANTE DE ORGANOS Grupo sanguíneo ABO Antígenos del CMH (HLA) Antígenos de Complejos Menores de Histocompatibilidad Requerimientos variables según órgano o tejido

OTROS ALOANTIGENOS LEWIS ANTIGENOS ENDOTELIO VASCULAR MICA / MICB (MICC, MICD, MICE son pseudogenes ) VIMENTINA

REQUERIMIENTOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD HIGADO CORAZON RIÑON MEDULA OSEA

LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD ANTIGENOS ANTICUERPOS

Estudios RECEPTOR DONANTE RECEPTOR/DONANTE Tipificación HLA Existencia de anticuerpos anti-HLA (panel de anticuerpos reactivos o PRA) pre-transplante Detección de la aparición de anticuerpos anti-HLA post-transplante DONANTE Tipificación de HLA RECEPTOR/DONANTE Prueba cruzada (crossmatch XM) Que es un paciente que tiene un reaccione contra mas de 50% del panel Responderdores que tiene un reaccione entre 1-49% del panel Y no respondeores que no tiene reaccione contra el panel, que no han formado anticuerpos.

EFECTO HLA EN TRASPLANTE RENAL SOBREVIDA INJERTO FRECUENCIA RECHAZOS AGUDOS GRADO INMUNOSUPRESION DISMINUYE RIESGO DE SENSIBILIZACION (IMPACTO ECONOMICO) Donante vivo/ donante cadavérico

HERENCIA CMH A1 B5 DR8 A2 B8 DR3 A9 B12 DR2 A3 B16 DR4 a b c d ac, ad , bc, bd HLA-A1,B5,DR8/ A9,B12,DR2 A1,B5,DR8/ A3,B16,DR4 A2,B8,DR3/ A9,B12,DR2 A2,B8,DR3/ A3,B16,DR4 25% idénticos 25% 0 match 50% semiidenticos

Tipificación de HLA Métodos serológicos: Métodos moleculares: CDC: citotoxicidad dependiente de complemento Métodos moleculares: PCR-SSP (iniciadores secuencia- específicos) PCR-SSO (sondas secuencia-específicas)

Métodos serológicos Identificacion Antigenos Placas con antisueros especificos (a-HLA A2, A3, B5, B7 etc) Celulas con antigenos a identificar Pesquisa de Anticuerpos Suero para determinar existencia anticuerpos Células con Antigenos conocidos

Tipificación: Métodos serológicos 2 x 106/ml lymphocytes Rabbit Complement 30 minutes incubation 1 hour incubation Dispense 1 l of T or B lymphocytes Dispense 5 l of Class I or II rabbit complement Dispense 10 l of Stain-Fix™ or 5 l of Fluoroquench™ Evaluation and Reporting

Tipificación: Métodos serológicos “1” Reaction 0–10% Dead Cells “2” Reaction 11–20% Dead Cells “4” Reaction 21–50% Dead Cells “6” Reaction 51–80% Dead Cells “8” Reaction 81–100% Dead Cells

TECNICAS MOLECULARES BAJA RESOLUCION: INFORMACION SIMILAR A LA SEROLOGIA kits CTS Biotest One Lambda RESOLUCION INTERMEDIA: PERMITE IDENTIFICAR GRUPOS DE ALELOS ALTA RESOLUCION: PERMITE IDENTIFICAR ALELOS Y SUS VARIANTES

Micro SSPTM Procedimiento 2. Agregar 10 ul de la solucion que contiene el DNA/mezcla-D a cada uno de los pozos de la micro-placa del SSP, con excepción del pocillos que es el control negativo. 1. Agregar Amplitaq de Perkin-Elmer y la muestra de DNA en el tubo de D-Mix 4. Transferir el producto de la reacción de PCR en un gel. 3. Termociclador (Perkin Elmer 9600)

Micro SSPTM Procedimiento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5. Correr la electroforesis. 6. Analizar los patrones de bandeo y asignar los alelos correspondientes. 7. Interpretación

TIPIFICACION HLA-A,B,DR Tipificación Serológíca Antígeno A28 B40 DR5 Subtipos A68 B61 DR11 Tipificación Molecular Baja resolución A*68 B*40 DRB1*11 Intermedia A*6801/6804 B*4001/4006 DRB1*1101/1104/1106 Alta resolución A*6801 B*4006 DRB1*1104

MATCH O COMPATIBILIDAD ANTIGENOS PRESENTES EN EL RECEPTOR Y EN EL DONANTE MISMATCH O INCOMPATIBILIDAD ANTIGENOS PRESENTES EN EL DONANTE Y AUSENTES EN EL RECEPTOR

EJEMPLO HLA-A1,3/ B8,16/ DR3,5 RECEPTOR HLA-A3,9/ B7,16/ DR5,8 PADRE HLA-A1,19/ B5,B8/ DR3,5 HERMANO

EJEMPLO R: HLA-A2, 9; B5, 44; DR5, 6 MADRE HLA-A3,9; B5,8 ; DR4,5 HNO1. HLA-A2,3; B5,8; DR4,8 HNO2. HLA-A2,9; B5 ; DR5,8 HNO3. HLA-A2,3; B8, 44; DR4,6

COMPATIBILIDAD (MATCH) E INCOMPATIBILIDAD (MISMATCH) RECEPTOR : HLA A1,2 ; B5,8 ; DR1,3 ; DONANTE 1: HLA A2,9 ; B8 ; DR1,3 DONANTE 2: HLA A2,9 ; B8 ; DR3 DONANTE 1 MATCH : 1A 1B 2DR MM : 1A 0B 0DR DONANTE 2 MATCH : 1A 1B 1DR MM : 1A 0B 0DR

UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1. UN EJEMPLO (1) CLASE II POR SSP BAJA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1* PACIENTE 23, 24 49, 62 04, - HERM. A 23, 24 49, 62 04, - HERM. B 23, 24 49, 62 04, - MADRE 23, 32 49, 60 04, - PADRE 24, - 62,- 04, -

UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1. UN EJEMPLO (2) CLASE II POR SSP ALTA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1* PACIENTE 23, 24 49, 62 0405, 0407 HERM. A 23, 24 49, 62 0404, 0407 HERM. B 23, 24 49, 62 0405, 0407 MADRE 23, 32 49, 60 0404, 0405 PADRE 24, - 62,- 0404, 0407

Antigenos y alelos

Antigenos y alelos HLA-DR HLA-DR

COMPATIBILIDAD DONANTE RECEPTOR MEDIBLE EN DISTINTOS NIVELES DE RESOLUCION DE ANTIGENOS HLA EN DISCUSION EL NIVEL AL CUAL EL MATCH HLA ES BENEFICIOSO

INMUNOGENICIDAD HLA MM PERMITIDOS MM PROHIBIDOS B7 en RECEPTOR A1 FENOTIPO RECEPTOR DR6: a-A10, A11, A19, B35 OTROS : Cw, DQ, DP

SENSIBILIZACION PRESENCIA DE ANTICUERPOS ALOREACTIVOS

CONSECUENCIAS DE LA SENSIBILIZACION Menor posibilidad de trasplante (XM positivo) Mayor tiempo en lista de espera Sobrevida menor del injerto renal HIPERSENSIBILIZADO (50%, 60%, 75%, 80%)

ANTICUERPOS ANTI-HLA RECHAZO HIPERAGUDO DEL INJERTO RECHAZO AGUDO HUMORAL DAÑO CRONICO DEL INJERTO

CADA MOLECULA HLA PUEDE TENER MUCHOS DETERMINANTES ANTIGENICOS DIFERENTES

ANTICUERPOS ANTI-HLA ANTIGENOS HLA SON ANTIGENOS T DEPENDIENTES RESPUESTA PRIMARIA IgM RESPUESTA SECUNDARIA IgG PRODUCCION DE CELULAS DE MEMORIA

VIAS DE SENSIBILIZACION EMBARAZOS TRANSFUSIONES TRASPLANTES (ANTICUERPOS NATURALES)

Detección de anticuerpos anti-HLA y especificidad Metodología CDC ELISA Citometria de flujo Detección por luminex (LABSCREEN®)

Detección de anticuerpos anti-HLA por CDC Panel de células (congeladas) PRA ( panel reactive antibody) Paneles diseñados para asegurar una cobertura máxima de antígenos Porcentaje de anticuerpos a-HLA 0% 100%

Detección de anticuerpos anti-HLA por ELISA Anfígenos son purificadas de líneas de células transformado por EBV. Detección de IgG o IgM – depende en el anticuerpo secundario que usan. Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e identificación de especificidad de los anticuerpos.

Detección de anticuerpos anti-HLA por FlowPRA™ Antígenos purificados acoplados a microperlas que pueden ser detectadas en un citómetro de flujo. Detección de anticuerpos IgG, IgM o IgA Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e identificación de especificidad de los anticuerpos.

Sensibilidad en detección de anticuerpos anti-HLA Mayor sensibilidad FlowPRA ELISA CDC Menor sensibilidad

CROSSMATCH (PRUEBA DE REACCION CRUZADA XM) Pesquisa de anticuerpos anti HLA en el suero del receptor, contra los antígenos del donante DISTINTOS METODOS: CDC: distintas células, tiempos de incubación, lavados, etc. CITOMETRIA FLUJO: mayor sensibilidad

IMPORTANCIA DE XM POSITIVO DEFINIR ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS

SENSIBILIZACION Y TRASPLANTE RENAL ANTICUERPOS anti-HLA ANTICUERPOS anti-NO HLA • ANTIGENOS MENORES DE HISTOCOMPATIBILIDAD • AUTOANTICUERPOS

XM (+) CONTRAINDICACION Tx XM (- ) BAJO RIESGO ANTIGUO ESCENARIO XM (+) CONTRAINDICACION Tx XM (- ) BAJO RIESGO CAMBIO DE CONCEPTO

ANTICUERPOS Y CROSSMATCH ANTICUERPOS (–) XM (–) ANTICUERPOS (–) XM (+) ANTICUERPOS (+) XM (+) ANTICUERPOS (+) XM (–)

DEFINIR RIESGO TOMA DE DECISION FRACASO EXITO

Risk assessment for antibody-mediated rejection Crossmatch result: IgG HLA-specific antibodies Contra High risk Intermediate Low risk indicated Current positive Cytotoxicity Flow cytometry Historical positive Current and historical negative Transplantation 2004, 78(2): 186

TIPOS DE DONANTES DONANTE VIVO DONANTE CADAVERICO

ORGANIZACIÓN PROGRAMA TRASPLANTE MINSAL FONASA HISTOCOMPATI- BILIDAD. I.S.P. Estudio DC Selección R LAB. VALDIVIA Regional CENTROS CENTROS TRASPLANTES PROCURA CORPORACION TX Pesquisa, procuramiento Coordinación

HISTOCOMPATIBILIDAD Y TRASPLANTES LISTA ESPERA D.CADAVER ABO ABO HLA-A,B,DR HLA-A,B,DR PRA ESPECIFICIDAD XM LT-LB

RELACION INJERTO/RECEPTOR HUESPED RECHAZA INJERTO INJERTO RECHAZA HUESPED TOLERANCIA INMUNOSUPRESION

¡ G R A C I A S !