TEMA 3. Algunas aplicaciones de la biotecnología genética a la biotecnología alimentaria 1- Diagnóstico de patologías hereditarias con repercusión sobre la cantidad o calidad de los productos 2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de los productos 3- Identificación genética individual, racial o específica 4- Detección de microorganismos en alimentos 5- Detección de transgénicos

OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) : 1. DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS HEREDITARIAS OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) : Base de datos de genes y enfermedades hereditarias en 137 especies animales DOG VACA GATO CERDO CABALLO OVEJA POLLO CABRA CONEJO OTROS TOTAL Total Caracteres 567 408 298 223 205 202 188 72 59 593 2815 mendelianos 204 119 66 37 88 79 81 11 21 117 773 Mendelianos (mutación conocida) 150 70 15 24 25 28 8 7 52 416 Potenciales modelos caracteres humanos 268 137 151 75 104 40 29 38 255 1172

Malignant hyperthermia (Phene ID 1193, Group 000621) in Sus scrofa Possible human homologue (MIM number) 145600 180901 Symbol PSS Cross Species Summary Malignant hyperthermia. A progressive increase in body temperature, muscle rigidity and metabolic acidosis, leading to rapid death. Summary In pigs, malignant hyperthermia (MH) leads to rapid post-mortem changes in muscle, resulting in pale soft exudative (PSE) meat. MH can be triggered by a minor stress, such as loading, transport, sexual intercourse, high ambient temperature, or exposure to the anaesthetic halothane. Susceptibility to halothane-induced MH is an autosomal recessive trait in pigs. Together, sudden death syndrome and PSE constitute porcine stress syndrome (PSS), which became a major economic problem in many countries in the 1970s. In part, this was due to strong selection for increased leanness, which is associated with susceptibility to PSS. In 1991, a major breakthrough occurred when a Canadian research team led by David MacLennan (Fujii et al., 1991) showed that MH is due to a base substitution (C-T) in the 1843rd nucleotide of the gene for the calcium release channel in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. The base substitution causes an amino-acid substitution (arginine - cysteine) in the 615th position of the calcium release channel, resulting in altered calcium flow. A PCR genotyping test based on the causative mutation has been used extensively in many countries, leading to the elimination of the mutation from many herds. Species Specific Name Porcine Stress Syndrome Genetic Test Various PCR genotyping tests have been devised, all based on detection of an RFLP resulting from the causative base substitution. Single Locus yes Characterised at a molecular level Yes

SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) El Síndrome Estrés Porcino (PSS) es una enfermedad hereditaria, que presenta un modelo de herencia recesiva SINTOMAS Taquicardia Rigidez muscular Aumento progresivo de la temperatura corporal Muerte LESIONES Hipertrofia muscular Edema pulmonar CARNES PSE (pale, soft, exhudative)- palidas, blandas y exhudativas- CARNES DFD (dark, firm, dry) – dura, seca y oscura

CARACTERÍSTICAS CARNES EN ANIMALES CON PSS Carne PSE Carne DFD Glucólisis, descenso pH muy rápido Lentamente y parcial Valor pH < 5,8 >6,2 (también pH) Color pálida oscura Consistencia blanda densa, pegajosa Capacidad de enlace de agua baja elevada Pérdida de líquidos alta Conservación reducida Dureza menor mayor  

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) Mutación en el gen de RYR-l: Receptor de la ryanodina- Gen para la liberación del calcio en el músculo esquelético - Sustitución C-T en el nucleótido 1843 Sustitución arginina–cisteina en al posición 615 C/C: Individuos sanos y no portadores C/T: Individuos sanos y portadores T/T: Individuos enfermos

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO PCR/RFLPs 199bp PCR 199bp Alelo C 165bp 34bp Alelo T BsiHKA I

2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de los productos Existen genes que determinan el sexo y que tiene una secuencia distinta en machos o en hembras Importante determinar el sexo del embrión para los programas MOET = ovulación múltiple y transferencia de embriones, pero también el origen de determinados productos en los que la características y el valor economico pueden variar según el sexo

GENES RELACIONADOS CON LA GRASA Más genes interesantes… GENES RELACIONADOS CON LA GRASA DAGT 1 en vacuno: tiene una gran influencia en la cantidad de grasa en la leche A G G A grasa en la leche Grasa en la leche SI ANALIZAMOS EL ADN DE LOS INDIVIDUOS PODREMOS SELECCIONAR DIRECTAMENTE POR EL GENOTIPO

HAY OTROS GENES DE INTERES RELACIONADOS CON CARACTERES PRODUCTIVOS K-Caseína - mayor rendimiento en la producción de queso IGF2 – Desarrollo muscular y depósitos grasos RYR 1 – Desarrollo muscular e hipertermia maligna Síndrome de estrés porcino (SSP) PRKAG 3 – Aumenta la cantidad de glucógeno del músculo en un 70% y el desarrollo muscular MIOSTATINA –Hipertrofia muscular o doble musculatura

GEN DE LA MIOSTATINA Hipertrofia muscular PERDIDA DE FUNCIÓN DEL GEN GENERA UN FENOTIPO SIMILAR EN LAS TRES ESPECIES DE MAMÍFEROS Hipertrofia muscular “ CULONES “ - mayor rendimiento a la canal - mayor proporción de músculo - menor proporción de hueso - mucha menor proporción de grasa Fotografías obtenidas de Genome research (Womack, 2005)

3. IDENTIFICACIÓN GENÉTICA AUTENTIFICACIÓN TRAZABILIDAD En ambos casos se trata de utilizar los marcadores del DNA con diferentes propósitos: 1.- Identificación individuos en diferentes etapas del proceso productivo (de la granja a la mesa)- Verificación de otros sistemas de identificación- Sistema trazabilidad 2.- Identificación de origen genético (raza). Verificación denominaciones de origen o marcas de calidad 3.- Identificación de especies. Identificación de especies en mezclas o sustituciones

Seguridad alimentaria PREOCUPACIÓN CRECIENTE ENTRE LOS CONSUMIDORES Crisis de las vacas locas, listeriosis, dioxinas, etc OBLIGATORIEDAD DE ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE TRAZABILIDAD

¿ Qué significa TRAZABILIDAD ? “Establecimiento de un sistema que permita identificar un animal y poder llevar a cabo el seguimiento de sus movimientos a lo largo de toda su vida desde el nacimiento hasta la llegada de su carne hasta el consumidor”

Marcadores utilizados : Sistema de trazabilidad genética Sistema basado en el análisis del ADN FUNDAMENTO: Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones. Marcadores utilizados : MICROSATÉLITES SNPs SISTEMA FIABLE Y REPETIBLE La información genética contenida en las células es igual en todas las partes del cuerpo del animal y no varía con el tiempo Como media, 1 de cada 1000 bases del ADN (de los 3.000.000.000) es diferente entre animales

IDENTIFICACIÓN DE ORIGEN RACIAL CONTROL DE CALIDAD Ejemplo: productos derivados de cerdo ibérico (UTILIZACIÓN DE MARCADORES ESPECÍFICOS DE RAZA) ANÁLISIS DE LOS GENES MC1R Y Pink PCR/RFLPs MC1R- Receptor de la melanocortina 1 Genes que determinan el color de la capa Pink MC1R y Pink presentan alelos fijados en la raza Duroc que no aparecen en poblaciones de cerdo ibérico Datos obtenidos de Fernández et al 2003

IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES de productos de calidad Autentificación Razones filosóficas y religiosas > Demanda de productos de calidad Cuestiones legales Fraudes económicos

Identificación de especies mediante RAPDs Aplicable a la detección de fraudes en patés C/Pt Pt O Pv Pll C Pt

Identificación de especies mediante RAPDs Aplicable a carne o a quesos 750 pb 340 pb 310 pb 290 pb Caprino Ovino Bovino

( Patente LAGENBIO- Universidad de Zaragoza ) Identificación de especie mediante amplificación de fragmento específico de porcino ( Patente LAGENBIO- Universidad de Zaragoza ) b o cp cv pll pv pt e - Muestras sanguíneas de diferentes especies- solamente se amplifica en cerdo

AMPLIFICACIÓN DEL FRAGMENTO ESPECÍFICO DE CERDO EN DIFERENTES RAZAS Pietrain Chato Murciano Landrace Large White

Cuantificación 1% 5% 10% 25% 50% 75% 100% Nos permite demostrar no solo que hay presencia de cerdo, sino en que proporción en una mezcla. 1% 5% 10% 25% 50% 75% 100%

SOLUCIÓN: LA MUESTRA PROBLEMA ES CORDERO Y NO CABRITO CASO PRACTICO.Identificación de especies por sustitución Denuncia de venta de cordero en lugar de cabrito en Navidad 08 Utilización de RAPDs Recepción en el laboratorio: muestra de carne Cabra 1 Cabra 2 Muestra problema Oveja 1 Oveja 2 vaca SOLUCIÓN: LA MUESTRA PROBLEMA ES CORDERO Y NO CABRITO

4.- DETECCIÓN DE MICRORGANISMOS EN ALIMENTOS Imprescindible en la Seguridad alimentaria - En los Estados Unidos se dan aproximadamente 76 millones de casos de intoxicación alimentaria (26.000 casos por cada 100.000 habitantes),5 de los que: 350.000 son hospitalizados (111 por 100.000 hab.) 5.000 mueren (1,7 por 100.000 hab.) - Salmonella , Listeria , Toxoplasma, Campilobacter, E.coli O157 son los agentes màs frecuentes en las infecciones causadas por alimentos

Tests genéticos aplicados a la detección de microorganismos - Se aplica la técnica de PCR - Se basa en la identificación de un fragmento de DNA específico del microrganismo contaminante

Bacterias en alimentos pueden ocasionar grandes pérdidas económicas Deterioran los alimentos Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación VENTAJAS Sensibilidad Especificidad Capacidad de procesamiento de gran número de muestras

DENTRO DEL PRIMER GRUPO (deterioran los alimentos): Detección rápida de bacterias productoras de exopolisacáridos del tipo beta-glucano. El uso de este método podría permitir la prevención del ahilamiento de bebidas alcohólicas en el que están implicados estos polisacáridos (especialmente la sidra). Detección gen gtf mediante PCR DENTRO DEL SEGUNDO GRUPO (causan enfermedades)

Microrganismos Trastorno Posible producto Método que ocasiona portador Carne de aves Arroz, prod. Lacteos Y cárnicos Aves, cerdo , res y Leche cruda Pescado, miel, latas Carne de res y aves, Salsas Carne y productos Lácteos Pate, leche, queso, carne Mariscos, ensalada de col Leche, huevo crudo, carne de res y ave Mayonesa, vegetales crudos Leche y aves Ostras crudas, pescado Leche, tofu, canales de cerdo Acrobacter spp Bacillus cereus Campilobacter spp Clostridium botulinum Clostridium perfringens E.Coli Listeria spp Salmonella spp Shigella spp Vibrio cholera Yersinia enterocolitica Diarrea Diarrea, vómitos Botulismo, vómitos Diarrea, dolor abd. Diarrea, colitis Listeriosis Gastroenteritis Fiebre , calambres Cólera Yersiniosis RAPD-PCR PCR PCR múltiple PCR anidado PCR duplex RT- PCR PCR-múltiple RT- PCR RT- PCR PCR simple

EXISTEN KITS COMERCIALES BAX (Qualicom, USA) Salmonella Listeria E.Coli O157:H7 PROBELIA (Sanofi, France) Salmonella Listeria TAQMAN (Perkin Elmer, USA) Salmonella Listeria E.Coli O 157

VENTAJAS DE LA TÉCNICA DE PCR EN LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS - Rapidez - Simplicidad (disponibilidad de Kits comerciales) - Alta sensibilidad ( permite diferenciar cepas) - PCR cuantitativo permite la cuantificación del nivel de patógenos

PCR - - Presencia de banda - Diagnóstico + Ausencia de banda - Diagnóstico -

ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO 5.- Detección de transgénicos ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO (Directiva 2001/18/CE) Cualquier organismo, con excepción de los seres humanos, cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento ni en la recombinación natural

ETIQUETADO La UE “reconoce el derecho de los consumidores a la información y el etiquetado como herramienta para una elección responsable” La obligatoriedad del etiquetado se regula en los reglamentos 1829 y 1830 / 2003 del Reglamento Europeo y del Consejo de 22 de Septiembre de 2003 - El etiquetado indicando la presencia de un OMG es obligatorio en todos los casos y sin depender de la cantidad de OMG presente

Creación de plantas transgénicas Genética Creación de plantas transgénicas Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1% Mediante técnica PCR Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes

DETECCIÓN POR PCR DE MAÍZ TRANSGÉNICO