T.P Nº 8: Diseño de oligonucleótidos

Objetivo: Diseño de oligonucleótidos adecuados para la amplificación mediante PCR de un fragmento interno del gen rpoS en Ps. alcaligenes

Estrés: ayuno en nutrientes, pH ácido, alta osmolaridad RpoS Estrés: ayuno en nutrientes, pH ácido, alta osmolaridad RpoS o S Por otro lado tenemos, el mecanismo de resistencia a estrés general o de fase estacionaria, que es una respuesta preventiva y reversible que incrementa la supervivencia bacterianan ante múltiples condiciones de estrés. Esta respuesta puede ser inducida por varias condiciones de estrés diferentes, tales como ayuno en nutrientes, pH ácido o alta osmolaridad. Dichas condiciones provocan la acumulación de un factor sigma de fase estacionaria denominado RpoS o sigmaS, que a su vez es capaz de activar la expresión de diversos genes que confieren resistencia al estrés, así como genes involucrados en re-arreglos morfológicos y genes que provocan cambios en el metabolismo celular Genes que confieren resistencia al estrés, genes involucrados en re-arreglos morfológicos y genes que provocan cambios en el metabolismo celular

Procedimiento En base de datos de secuencias proteicas buscar secuencias correspondientes a RpoS de Pseudomonas. Elegir 4 de estas secuencias y armar con ellas un archivo en formato FASTA Buscar las regiones de homología utilizando el ClustalW

ClustalW

Procedimiento 4) Elegir regiones de homología situadas a una distancia adecuada (50 aa = 150 nucleótidos) 5) Reconstruir la secuencia nucleotídica de los nucleótidos elegidos, teniendo en cuenta los diferentes codones para un mismo aminoácido y el uso de codones para P. alcaligenes

Ejemplo Secuencia aminoacídica elegida PDA(A o E)WDG   Secuencia aminoacídica elegida PDA(A o E)WDG 2) Reconstrucción de secuencia nucleotídica    

Código genético A (Ala) R (Arg) N (Asn) D (Asp) C (Cys) Q (Gln) E (Glt) GCA GCC GCG GCT CGA CGC CGG CGT AGA AGG AAC AAT GAC GAT TGC TGT CAA CAG GAA GAG   G (Gly) H (His) I (Ile) L (Leu) K (Lys) M (Met) F (Fen) GGA GGC GGG GGT CAC CAT ATA ATC ATT CTA CTC CTG CTT TTA TTG AAA AAG ATG TTC TTT P (Pro) S (Ser) T (Thr) W (Trp) Y (Tyr) V (Val) CCA CCC CCG CCT TCA TCC TCG TCT AGC AGT ACA ACC ACG ACT TGG TAC TAT GTA GTC GTG GTT

Codon usage para P oleovorans

Elegir la region de 18 a 21 nucleotidos menos “degenerada” AspGluGlyPheLeuSerTyrCysTrpLeuProHisGln GATGAAGGTTTTCTTTCTTATTGTTGGCTTCCTCATCAA   C  G  C  CT CAGC  C  C   T C  C  C  G          A     A  A           A  A           G     G  G           G  G  Elegir la region de 18 a 21 nucleotidos menos “degenerada” Un total de 32 oligonucleotidos se generan para dar lugar al peptido . TATTGTTGGCTTCC TACTGTTGGCTTCC TATTGCTGGCTTCC TACTGCTGGCTTCC etc.  

Nucleótidos complementarios Nomenclatura para nucleótidos degenerados Nucleótidos degenerados: B = C ó G ó T D = A ó G ó T H = A ó C ó T K = G ó T M = A ó C N = A ó C ó G ó T R = A ó G S = G ó C V = A ó C ó G W = A ó T Y = C ó T Nucleótidos complementarios C – G A - T B – V D - H K – M N - N R – Y S – S W –W

Para diseñar primers Tamaño del oligonucleótido y del producto Temperatura de fusión (Tm) Especificidad Secuencias complementarias Contenido en G/C y cadenas de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G) Secuencia 3’ terminal. Secuencia 5’ terminal y regiones centrales

18 a 24 bases Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Tamaño del oligonucleótido Temperatura de fusión (Tm) Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Tann: 5- 8 °C más baja que la de fusión

45% al 55% Contenido en G/C Complementariedad Ideal mezcla al azar un contenido en GC del 50% y ~ 20 bases (la Tm estaría en el rango de 56°C – 62°C). Complementariedad NO estructuras secundarias o dímeros o doble cadena Secuencia 3’-terminal CG Clamp Secuencia 5’-terminal y regiones centrales

Resumén de Criterios “positivos” para el diseño de primers     Temperatura de fusión (Tm) TmForward = TmReverse Tm = 55-62ºC T hibridación ~ 5-8ºC menos que la Tm Tamaño del primer 12-30 b, óptimo 18 a 24 b Distancia entre primers 10 b-10 kb Contenido en G+C >= secuencia diana; ideal del 45% al 55% “cepo GC” en 3’ termina en T; G o C en dos (máx.) de cinco últimas bases “cepo GC” en 5’ incluir varias G o C en las últimas bases Lugares de apareamiento de de primers únicos  

Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Online

http://molbiol-tools.ca/PCR.htm

Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Uso del programa DNAMAN