María Claudia Atencia Pineda María De Jesús Pérez Gil Facultad de Educación y Ciencias Programa de Biología Sincelejo – Sucre 2014 ESTRUCTURA GENÉTICA.

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1 María Claudia Atencia Pineda María De Jesús Pérez Gil Facultad de Educación y Ciencias Programa de Biología Sincelejo – Sucre 2014 ESTRUCTURA GENÉTICA DE POBLACIONES DEL MOSQUITO Aedes aegypti DEL DEPARTAMENTO DE SUCRE Y DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN F1534C QUE CONFIERE RESISTENCIA CRUZADA A DDT/PIRETROIDES EN EL MUNICIPIO DE SINCELEJO

2 Director: M.Sc. Eduar Elías Bejarano Martínez Codirectoras: Bsc. María Cristina Jaramillo Salazar Sandy Milena Caldera García Laboratorio de Investigaciones Biomédicas Universidad de Sucre ESTRUCTURA GENÉTICA DE POBLACIONES DEL MOSQUITO Aedes aegypti DEL DEPARTAMENTO DE SUCRE Y DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN F1534C QUE CONFIERE RESISTENCIA CRUZADA A DDT/PIRETROIDES EN EL MUNICIPIO DE SINCELEJO

3 Introducción Especie de mosquito de mayor importancia en el área urbana. Hábitos antropofílicos, selváticos y domésticos. Originario de África. Distribución en áreas tropicales y subtropicales del mundo. Aedes aegypti (Linnaeus, 1762)

4 Reino: Animalia Phylum: Arthropoda Clase: Insecta Orden: Diptera Familia: Culicidae Género: Aedes Especie: Aedes aegypti (Linnaeus, 1762). Taxonomía de Aedes aegypti Introducción

5 Mosquito de color oscuro. El cuerpo es pequeño, menor de 5 mm de longitud. Con bandas blancas basales en los segmentos tarsales. El tórax presenta un diseño en forma de lira. Características de Aedes aegypti Introducción

6 Ciclo de vida de Aedes aegypti Introducción

7 Distribución de Aedes aegypti Marco teórico

8 40% de la población mundial Marco teórico Importancia epidemiológica Principal trasmisor del virus Dengue

9 Sucre: Área endémica para la enfermedad. Año 2012. 2.078 casos totales de Dengue 2.043 de Dengue (98.3%) 35 de Dengue Grave (1.7%) Año 2013. 3.552 casos totales de Dengue 3.444 de Dengue (97%) 108 de Dengue Grave (3 %) Sincelejo, Buenavista, Sampués, Corozal, Morroa y Toluviejo Brote por Dengue Marco teórico

10 Control vectorial Envenenamiento por contactoEnvenenamiento oralFumigaciones

11 Marco teórico Resistencia en insectos vectores  Resistencia múltiple  Resistencia cruzada Mecanismos de resistencia en insectos. Resistencia por alteraciones en el sitio de acción del insecticida.  Alteraciones en el Canal de Sodio dependiente de voltaje(Kdr) Resistencia Metabólica.

12 Modo de acción de los insecticidas Marco teórico

13 Modo de acción de los insecticidas Piretroides Fuente: http://www.youtube.com/watch?v=8X31U9xyqDw

14 Marco teórico Dinámica poblacional de Aedes aegypti CONTROL VECTORIAL Adaptación ecológica Epidemiologia de la enfermedad Resistencia a insecticidas

15 Objetivos Objetivo General Determinar la variabilidad y estructura genética de las poblaciones de Aedes aegypti de cuatro municipios del departamento de Sucre mediante el análisis de la secuencia del gen mitocondrial ND4 y establecer el estado de la resistencia cruzada a DDT/piretroides en Sincelejo mediante la detección de la mutación F1534C.

16  Determinar el grado de polimorfismo presente en la secuencia nucleotídica del gen mitocondrial ND4 en poblaciones naturales de Aedes aegypti de Sincelejo, Sampués, Corozal y Guaranda, para inferir los niveles de flujo génico y la estructura de las poblaciones.  Detectar la mutación F1534C del gen nuclear que codifica para el canal de sodio dependiente de voltaje, que confiere resistencia cruzada a los insecticidas DDT/piretroides, en la población de Aedes aegypti de los barrios Puerta Roja y Las Delicias del municipio de Sincelejo. Objetivos Objetivos Específicos

17 Metodología Área de estudio Sincelejo

18 Metodología Área de estudio Sampués

19 Metodología Área de estudio Corozal

20 Metodología Área de estudio Guaranda

21 Metodología Extracción y cuantificación de ADN 120 μl del búffer de lisis (NaCl 1 M, Sacarosa 1 M, EDTA 1 M, SDS 10%, Tris- HCL 1 M a pH de 8.0), 6 μl de proteinasa K 65°C durante 5 horas 95º durante 10 minutos 28 μl de Acetato de Potasio 1 hora 12.000 rpm x 30 min etanol absoluto 12.000 rpm x 20 min etanol al 70% 12.000 rpm x 10 min 49°C 50 μl H2O estéril COLLINS, et al. En: Am J Trop Med Hyg. 1987. vol. 37, no. 1, p. 37- 41. modificado por Jaramillo & Caldera. 2010

22 Metodología Amplificación del gen mitocondrial ND4 de Aedes aegypti (PCR) ND4F ATTGCCTAAGGCTCATGTAG ND4R TCGGCTTCCTAGTCGTTCAT 25μl 5 mM MgCL2, 0.2 de cada deoxinucleótido 0.4 µM de cada cebador 5 μl de Buffer Promega (sin MgCL2) 2 und de Taq polimerasa 1 μl de ADN H2O ultra pura estéril Etapa I: 1 ciclo desnt. a 94°C X 5 min. Etapa II: 35 ciclos: a 94°C X 1min, alineamiento a 56°C X 30 Seg y extensión a 72°C durante 1min. Extensión final: 72 ºC por 7 min. Bracco et al. En: Mem Inst Oswaldo Cruz. 2007 Vol. 102(5): 573-580

23 Metodología Electroforesis en gel de agarosa del gen mitocondrial ND4 90ml TBE 0.5X Agarosa al 1% para ND4 2 μL Gelstar 2 µl buffer de carga 4 µl de cada muestra Corrido electroforético 50 min 90 V Visualizados fotodocumentador

24 Metodología Edición, alineamiento y análisis de las secuencias de ADN Programa MEGA versión 5.0

25 Resultados y Discusión MunicipioLocalidadNCoordenadas Geográficas Sincelejo Las Mercedes5 9° 18’ N, 75° 25’ O Florencia6 Las Delicias4 Puerta Roja4 Cortijo6 Botero12 Divino Salvador4 Sevilla1 20 de Julio1 Total43 Sampués Doce de Octubre8 9° 10’ N, 75° 22’ O Balcones de Rio13 Total21 Corozal Dager Chadid10 9° 19’ N, 75° 17’ O Cartagena de Indias12 Total22 Guaranda San Joaquín18 8° 28’ N, 74° 32’ O Calle Sexta4 Total22 Total108 Poblaciones de estudio

26 Amplificación del gen mitocondrial ND4 Resultados y Discusión

27 Secuenciación y edición del gen mitocondrial ND4 en Aedes aegypti 357 nucleótidos

28 SecuenciaT(U)CAGTotalSecuenciaT(U)CAGTotal SM1L133042,99,028,319,9357SBT4L215941,210,428,020,4357 SM1L155942,69,028,320,2357SBT4L216041,210,428,020,4357 SM3L123642,99,028,319,9357SBT5L214041,210,428,020,4357 SM3L125841,210,428,020,4357SBT5L214142,69,028,320,2357 SM3L125942,99,028,319,9357SBT5L214242,69,028,320,2357 SD2L72941,210,428,020,4357SBT5L214342,99,028,319,9357 SD3L92442,69,028,320,2357SBT5L214742,99,028,319,9357 SD5L87141,210,428,020,4357SBT5L214842,69,028,320,2357 SD5L91342,99,028,319,9357SC1L217442,69,028,320,2357 SSE2L128042,69,028,320,2357SC1L217542,69,028,320,2357 SPR29R41,210,428,020,4357SC4L217642,69,028,320,2357 SPR30R42,69,028,320,2357SC4L217841,210,428,020,4357 SPR31R42,99,028,319,9357SC5L217942,99,028,319,9357 SPR33R41,210,428,020,4357SC7L218242,99,028,319,9357 SDE47R42,99,028,319,9357SSO2L213441,210,428,020,4357 SDE50R42,99,028,319,9357SSO2L213542,99,028,319,9357 SDE52R42,69,028,320,2357SSO2L216341,210,428,020,4357 SDE54R41,210,428,020,4357SSO2L216441,210,428,020,4357 SF1L212242,69,028,320,2357SSO4L215341,210,428,020,4357 SF1L212342,99,028,319,9357SSO4L215441,210,428,020,4357 SF1L212442,99,028,319,9357SSO5L213641,210,428,020,4357 SF1L212542,69,028,320,2357SSO5L213841,210,428,020,4357 SF1L212842,99,027,720,4357SBR1L214441,210,428,020,4357 SF1L213042,99,028,319,9357SBR1L214541,210,428,020,4357 SJ1L213941,210,428,020,4357SBR1L215141,210,428,020,4357 SBT1L215042,99,028,319,9357SBR2L215442,99,028,319,9357 SBT2L215241,210,428,020,4357SBR2L215741,210,428,020,4357 SBT3L114942,99,028,319,9357SBR2L216141,210,428,020,4357 SBT4L215841,210,428,020,4357SBR2L216241,210,428,020,4357 Resultados y Discusión Composición y frecuencia nucleotídica de las secuencias de Aedes aegypti analizadas

29 SecuenciaT(U)CAGTotalSecuenciaT(U)CAGTotal SBR3L216642,99,028,319,9357SCC5L221742,99,028,319,9357 SBR3L216742,99,028,319,9357SCC5L221842,69,028,320,2357 SBR4L215141,210,428,020,4357SGS2AL242,99,028,319,9357 SBR4L215241,210,428,020,4357SGS2BL184041,210,428,020,4357 SBR5L215542,99,028,319,9357SGS2BL184242,99,028,319,9357 SBR5L2156B41,210,428,020,4357SGS3L186841,210,428,020,4357 SCD1L220042,99,028,319,9357SGS3L187142,99,028,319,9357 SCD1L220142,69,028,320,2357SGS3L187242,99,028,319,9357 SCD1L222742,69,028,320,2357SGS3L187342,99,028,319,9357 SCD1L222842,99,028,319,9357SGS4L193242,99,028,319,9357 SCD1L222941,210,428,020,4357SGS4L193342,99,028,319,9357 SCD4L223941,210,428,020,4357SGS4L193542,99,028,319,9357 SCD4L224142,99,028,319,9357SGS4L194342,99,028,319,9357 SCD5L223142,69,028,320,2357SGS4L194842,99,028,319,9357 SCD5L223341,210,428,020,4357SGS4L212142,69,028,320,2357 SCD5L231342,69,028,320,2357SGS5L200542,99,028,319,9357 SCC2L222042,69,028,320,2357SGS5L201842,99,028,319,9357 SCC2L222142,69,028,320,2357SGS5L203342,99,028,319,9357 SCC2L222242,69,028,320,2357SGS5L203542,99,028,319,9357 SCC3L227541,210,428,020,4357SGS5L204042,99,028,319,9357 SCC3L232442,99,028,319,9357SGC6a4L197842,99,028,319,9357 SCC3L232542,69,028,320,2357SGC6a4L199342,99,028,319,9357 SCC3L232642,99,028,319,9357SGC6a4L200042,99,028,319,9357 SCC4L219942,99,028,319,9357SGC6a5L187542,99,028,319,9357 SCC5L221442,69,028,320,2357 SCC5L221642,69,028,320,2357PROMEDIO42,29,428,220,1357 Resultados y Discusión Composición y frecuencia nucleotídica de las secuencias de Aedes aegypti analizadas

30 AMINOÁCIDONÚMEROPORCENTAJECODONES/AA Ala (A)8646,72278 Cys (C)3242,5213 Asp (D)1080,84031 Glu (E)2161,68072 Phe (F)3242,5213 Gly (G)151211,76514 His (H)3242,5213 Ile (I)10808,403410 Lys (K)3242,5213 Leu (L)226818,48721 Met (M)8646,72278 Asn (N)3242,5213 Pro (P)1080,84031 Gln (Q)2161,68072 Arg (R)2161,68072 Ser (S)140410,92413 Thr (T)3242,5213 Val (V)9727,5639 Trp (W)3242,5213 Tyr (Y)6485,0426 Resultados y Discusión Contenido aminoacídico promedio de la proteína codificada Hidrofóbicos 119 AA Hidrofílica

31 POSICIONES H15182172111132141189216234267270276312 H1TTTTACTTATATTC H2.C......G..A.T H3C.CC.TCCGCGACT H4.... G...G..... Resultados y Discusión Variabilidad Genética 10 transversiones de (T C) y 4 transiciones: 3(A G) 1(T A) Caldera et al, (2013) H10 (36)Urdaneta et al (2008) H6 (30)Yañez et al (2013) H5 (49)

32 Municipio LocalidadH1H2H3H4Total Sincelejo Las Mercedes3115 D. Salvador1124 Puerta Roja1124 Las Delicias2114 Florencia3216 Botero43512 Cortijo2316 Sevilla11 20 de Julio11 Sampués Doce de Octubre178 Balcones de Rio4913 Corozal Dager Chadid34310 C. de Indias47112 Guaranda San Joaquín151218 Calle Sexta44 Total4725351108 Frecuencia Haplotipica43,52%23,25%32,41%0,93% Publicaciones Amazonia Brasilera México Brasil Perú Resultados y Discusión Frecuencia Haplotípica H5 Aislado 3 Clon 17 H1 Cepa 2 H7 y H3 H6 H11 Aislado 6 Clon 8 (Lima & Scarpassa, 2009) (Gorrochotegui-Escalante et al, 2002) Paduan & Ribolla, 2008 y Costa et al, 2006 Da Costa –da silva et al, 2005. Clon 19

33 Resultados y Discusión Frecuencia Haplotípica

34 Resultados y Discusión Red de Haplotipos

35 POBLACIÓNNHNVKDHΠ SINCELEJO4145,754310,6860,01612 SAMPUES2124,459930,3720,01249 COROZAL3134,583510,6300,01284 GUARANDA3132,334040,2490,00654 TOTAL4145,823260,6550,01631 NH: N ú mero de Haplotipos; NV: N ú mero de sitios variables; K: N ú mero promedio de diferencia de nucle ó tido; DH: Diversidad de haplotipos; π: Diversidad de nucle ó tidos. Resultados y Discusión Diversidad Genética  Amazonas obtuvo valores de DH= 0.666. (Lima y Scarpassa, 2009)  Municipios del norte de Colombia obtuvo un valor de DH= 0,6794 (Caldera et al 2013)  Anopheles trinkae (DH= 0.559; π= 0,0076) (Conn et al, 1997)  Anopheles nuneztovari (DH= 0.564; π= 0,0063) (Scarpassa et al, 2000).

36 POBLACIÓN TEST Tajima's DFu and Li's DFu and Li's FFu's Fs SINCELEJO 2,97494**1,55027* 2,44915 ++ 13,621 SAMPUES1,828781,47579*1,87402*12,955 COROZAL1,636461,50879*1,82951*10,391 GUARANDA-0,671481,50879*0,031635,429 TOTAL 3,67357***1,52183 2,8713 ++ 18,705 Test de Neutralidad Resultados y Discusión P 0.10, P P>0.05 Teoría Neutral Selección Positiva (Selección Balanceadora)

37 Tipos de variaciónGLSC Componentes de la varianza Porcentaje de variación Interpoblacional370.6430.81780Va25.98 Intrapoblacional104242.3572.33036Vb74.02 Total107313.0003.14815 Índice de fijación:Fst: 0.25977 Va and FST: P (rand. value > obs. value) = 0.00000 P (rand. value = obs. value) = 0.00000 P-value = 0.00000+-0.00000 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) Resultados y Discusión

38  Al comparar el porcentaje de variación interpoblacional, el índice F ST obtenido en el AMOVA:  Fue más bajo el porcentaje de variación interpoblacional pero el valor del índice de fijación es parecido al obtenido en nuestro trabajo Brasil: 18,87%, FSC= 0,210. Lima y Scarpassa (2009) Venezuela 11,58%, FSC = 0,130. Herrera et al (2006) Municipios del norte de Colombia 15%, PhiRT = 0,154. Caldera et al (2013) Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) Resultados y Discusión

39 POBLACIONESSincelejoSampuésCorozalGuaranda Sincelejo Sampués Corozal Guaranda - 0.25637* -0.00036 0.17440* 1.45034 - 0.039946* 0.59467* Inf 0.75168 - 0.22237* 2.36697 0.34080 1.74854 - Resultados y Discusión Estimación del Flujo Génico Distancias genéticas F ST (valores en rojo) y Número de migrantes efectivos Nm (valores en azul).

40  Detectar la mutación F1534C del gen nuclear que codifica para el canal de sodio dependiente de voltaje, que confiere resistencia cruzada a los insecticidas DDT/piretroides, en la población de Aedes aegypti de los barrios Puerta Roja y Las Delicias del municipio de Sincelejo. Objetivos Objetivos Específicos

41 Extracción de ADN de 9 individuos donados por la S. de Salud Bioensayos de susceptibilidad realizados por la secretaria de salud departamental: resistencia a Lambdacialotrina Metodología Extracción de ADN de los individuos Aedes aegypti COLLINS, et al. En: Am J Trop Med Hyg. 1987. vol. 37, no. 1, p. 37- 41. Modificado por Jaramillo & Caldera. 2010

42 Amplificación del Exón 31 del gen “para” del canal de sodio dependiente de voltaje AaEx31PF TCGCGGGAGGTAAGTTATTG AaEx31QR GTTGATGTGCGATGGAAATG AaEx31wt CCTCTACTTTGTGTTCTTCATCATCTT AaEx31mut GCGTGAAGAACGACCCGC Metodología HARRIS, et al. En: Am. J. Trop. Med. Hyg. 2010. vol. 83, no. 2, p. 277-284.

43 Amplificación del Exón 31 del gen “para” del canal de sodio dependiente de voltaje AaEx31PF TCGCGGGAGGTAAGTTATTG AaEx31QR GTTGATGTGCGATGGAAATG AaEx31wt CCTCTACTTTGTGTTCTTCATCATCTT AaEx31mut GCGTGAAGAACGACCCGC 25μl 5 mM MgCL2, 0.2 de cada deoxinucleótido 0.4 µM de cada cebador 5 μl de Buffer Promega (sin MgCL2) 2 und de Taq polimerasa 1 μl de ADN H2O ultra pura estéril Etapa I: 1 ciclo a 95°C X 5 min. Etapa II: 35 ciclos: x 30 seg a 94°C alineamiento a 63°C X 30 Seg y extensión a 72°C X 30 seg. Extensión final: 72 ºC X 10 min. Metodología HARRIS, et al. En: Am. J. Trop. Med. Hyg. 2010. vol. 83, no. 2, p. 277-284.

44 Metodología Electroforesis en gel de agarosa, secuenciación y edición del genotipo (Kdr) 90ml TBE 0.5X Agarosa al 2% Corrido electroforético 40 min 100 V Visualizados fotodocomentador

45 Resultados y Discusión Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos de PCR amplificados con el tetraplex de primer (Harris et al, 2010). A:Banda control del 350pb aproximadamente. B: Bandas de 231pb (“wild-type) y 163 pb (“mutant”) aproximadamente. F/C heterocigotos resistentes. La amplificación del Exón 31 del gen “para” canal de sodio dependiente de voltaje Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides.

46 Resultados y Discusión Secuenciación y edición del Exón 31 del gen “para” del canal de sodio Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. 325 nucleótidos 151 nucleótidos 216 nucleótidos

47 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 1 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 5 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 1 Ae.aegyptiPR1w TTC TTC ATC ATC TTC GGG TCG TTC TTC ACG C Ae.aegyptiPR1m.............G................. Ae.aegyptiPR1c.............G................. Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. Cambio de nucleótido (T G)

48 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 Rockefeller AGT TAT TGT GAA ATC GAA CTT GTT ACG AAT GAT CTG CTT ACA ATT TTA CGT CCT CGA TCC EU399181.1 CTG.TC CAG.TG GCA ACG T.C AAG GGC TGG ATC.A. A.C.TG.AC GAC GCC ATC GAC..G Aedesaegypti............................................................ 111 111 111 111 111 111 111 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 Rockefeller TTC CAG GTG GGA AAG CAG CCG ATT CGC GAG ACC AAC ATC TAC ATG TAC CTC TAC TTT GTG EU399181.1 CGG G........................................................ Aedesaegypti............................................................ 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 555 666 666 666 677 777 777 778 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 Rockefeller TTC TTC ATC ATC TTC GGG TCG TTC TTC ACG CTG AAT CTG TTC ATC GGT GTC ATC ATC GAC EU399181.1............................................................ Aedesaegypti.............G.............................................. Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. Secuencia del Exón 31 del gen “para” del canal de sodio dependiente de voltaje

49 111 111 111 111 111 111 122 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 888 888 888 999 999 999 900 000 000 001 111 111 111 222 222 222 233 333 333 334 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 Rockefeller AAC TTC AAC GAG CAG AAG AAG AAA GCC GGT GGC TCA CTG GAA ATG TTC ATG ACG GAG GAT EU399181.1............................................................ Aedesaegypti............................................................ 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 223 444 444 444 555 555 555 566 666 666 667 777 777 777 888 888 888 899 999 999 990 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 Rockefeller CAG AAA AAG TAC TAC AAC GCC ATG AAA AAG ATG GGC TCG AAG AAG CCG CTG AAA GCT ATT EU399181.1............................................................ Aedesaegypti............................................................ 333 333 333 333 333 333 333 333 3 000 000 000 111 111 111 122 222 2 123 456 789 012 345 678 901 234 5 Rockefeller CCA CGG CCT AGG GTA AGG CAT TTC C EU399181.1............ TGG C.A.CA CAA G Aedesaegypti......................... Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. Secuencia del Exón 31 del gen “para” del canal de sodio dependiente de voltaje

50 Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. Secuencia del Exón 31 del gen “para” del canal de sodio dependiente de voltaje 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 666 666 666 777 777 777 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 Aedesaegypti AGT TAT TGT GAA ATC GAA CTT GTT ACG AAT GAT CTG CTT ACA ATT TTA CGT CCT CGA TCC TTC CAG GTG GGA AAG CAG 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 Aedesaegypti CCG ATT CGC GAG ACC AAC ATC TAC ATG TAC CTC TAC TTT GTG TTC TTC ATC ATC TGC GGG TCG TTC TTC ACG CTG AAT 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 122 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 555 666 666 666 677 777 777 778 888 888 888 999 999 999 900 000 000 001 111 111 111 222 222 222 233 333 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 Aedesaegypti CTG TTC ATC GGT GTC ATC ATC GAC AAC TTC AAC GAG CAG AAG AAG AAA GCC GGT GGC TCA CTG GAA ATG TTC ATG ACG 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 223 333 333 333 333 333 334 444 444 444 555 555 555 566 666 666 667 777 777 777 888 888 888 899 999 999 990 000 000 000 111 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 Aedesaegypti GAG GAT CAG AAA AAG TAC TAC AAC GCC ATG AAA AAG ATG GGC TCG AAG AAG CCG CTG AAA GCT ATT CCA CGG CCT AGG 333 333 333 333 3 111 111 122 222 2 345 678 901 234 5 Aedesaegypti GTA AGG CAT TTC C

51 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 Rockefeller AGT TAT TGT GAA ATC GAA CTT GTT ACG AAT GAT CTG CTT ACA ATT TTA CGT CCT CGA TCC EU399181.1 CTG.TC CAG.TG GCA ACG T.C AAG GGC TGG ATC.A. A.C.TG.AC GAC GCC ATC GAC..G Aedesaegypti............................................................ 111 111 111 111 111 111 111 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 Rockefeller TTC CAG GTG GGA AAG CAG CCG ATT CGC GAG ACC AAC ATC TAC ATG TAC CTC TAC TTT GTG EU399181.1 CGG G........................................................ Aedesaegypti............................................................ 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 555 666 666 666 677 777 777 778 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 Rockefeller TTC TTC ATC ATC TTC GGG TCG TTC TTC ACG CTG AAT CTG TTC ATC GGT GTC ATC ATC GAC EU399181.1............................................................ Aedesaegypti.............G.............................................. Resultados y Discusión La sustitución encontrada en el codón 1534, dominio IIIS6 del canal de sodio. Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. Secuencia del Exón 31 del gen “para” del canal de sodio dependiente de voltaje TGCTGC

52 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 Rockefeller SYC EIE LVT NDL LTI LRP RSF QVG KQP IRE TNI YMY LYF VFF IIF GSF FTL NLF IGV Q6DLT3 LFQ VAT FKG WIQ IMN DAI D.R E................................... Aedesaegypti............................................C............ 111 111 111 556 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 Rockefeller IID NFN EQK KKA GGS LEM FMT EDQ KKY YNA MKK MGS KKP LKA IPR PRV RHF Q6DLT3...............................................W RPQ Aedesaegypti................................................... Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. Secuencia aminoacídica del Exón 31 del gen “para” del canal de sodio dependiente de voltaje 108 AA

53 AMINOÁCIDOPORCENTAJECODONESA/A Ala (A)2,77783 Cys (C)1,85192 Asp (D)2,77783 Glu (E)5,55566 Phe (F)9,259310 Gly (G)5,55566 His (H)0,92591 Ile (I)9,259310 Lys (K)10,18511 Leu (L)8,33339 Met (M)4,62965 Asn (N)5,55566 Pro (P)4,62965 Gln (Q)3,70374 Arg (R)5,55566 Ser (S)4,62965 Thr (T)4,62965 Val (V)4,62965 Trp (W)00 Tyr (Y)5,55566 Total108 AA Frecuencia Aminoacídica Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. Hidrofóbicos Hidrofílicos

54  La resistencia knockdown o kdr  Es un importante mecanismo de resistencia cruzada al DDT y Piretroides Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides.

55 Isla Gran Caimán F1534C Harris et al (2010) Tapachula, Chiapas F1534C Aponte (2011) Norte de Tailandia F1552C Yanola et al (2010) Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides. Estudios Bioensayos: Anaya (2008)

56  Los resultados obtenidos en este trabajo son consistentes con los resultados obtenidos por Anaya (2008)  Encontró un alto nivel de resistencia al insecticida organoclorado DDT en las poblaciones del Cortijo y Botero del municipio de Sincelejo  También hallo una disminución de la susceptibilidad frente a los piretroides Lambdacyhalotrina y Deltametrina Estudios Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides.

57  Los tres haplotipos encontrados (H1, H2 y H3) de los individuos de Aedes aegypti de la localidad de Las Delicias y Puerta Roja, tienen el alelo mutante F1534C  La presión ejercida por los insecticidas aplicados para el control vectorial causa una selección en los individuos de la población, conllevando a que los individuos resistentes pasen a la siguiente generación Resultados y Discusión Detección de la mutación F1534C que confiere resistencia a DDT/Piretroides.

58  Se detectaron cuatro haplotipos en los aislados de Ae. aegypti de la población de Sincelejo, Sampués, Corozal y Guaranda. Los haplotipos H1, H3 y H2 fueron los más frecuentes y se encuentran relacionados con los hallados en Brasil, México y Perú.  Se registra la presencia de un nuevo haplotipo (H4) para el departamento de Sucre que solo había sido reportado en Brasil, lo que evidencia que este haplotipo pudo haber entrado a Colombia desde la amazonia brasileña distribuyéndose en el resto del país. Conclusiones

59  Las estimaciones de flujo génico revelado por los valores de Nm reflejaron un restringido intercambio de genes entre las poblaciones estudiadas, exceptuando el par Sincelejo – Corozal (Nm= Inf) que se comportan como una gran población.  Individuos de Aedes aegypti de la localidad de Las Delicias y Puerta Roja fueron heterocigotos para la mutación F1534C que confiere resistencia cruzada a los insecticidas DDT/Piretroides. Conclusiones

60  Ampliar los estudios a todo el departamento de Sucre principalmente en zonas donde se ejerza una presión constante con insecticidas, sin dejar a un lado los sitios libres de este tipo de presión para así evaluar su efecto en la variación genética entre las poblaciones de Ae. aegypti.  Se sugiere realizar estudios de detección molecular de resistencia a insecticidas en todo el departamento para mejorar los programas de control del vector Aedes aegypti.  Se recomienda hacer estudios de competencia vectorial en estas poblaciones para determinar si la variación genética de las poblaciones de Aedes aegypti influye en la competencia vectorial al virus Dengue. Recomendaciones

61  Agradecemos a Dios por protegernos durante todo nuestro camino y darnos fuerzas para superar obstáculos y dificultades a lo largo de toda nuestra vida.  A nuestros padres, que nos han enseñado a no desfallecer ni rendirnos ante nada y siempre perseverar a través de sus sabios consejos.  A la UNIVERSIDAD DE SUCRE por darnos la oportunidad de estudiar y ser profesionales.  Al profesor Eduar Elías Bejarano Martínez, a María Cristina Jaramillo y Sandy Caldera, quienes confiaron en nosotras y con sus conocimientos y su experiencia fueron la guía idónea durante todo el proceso que se llevo a cabo para realizar este trabajo. Agradecimientos

62  De igual manera agradecemos al profesor Pedro Blanco y Alveiro Pérez porque aportaron un granito de arena a nuestra formación.  A la entomóloga Suljey Cochero de la Secretaria Departamental de Sucre, por habernos donado los mosquitos con los cuales fue posible establecer el estado de la resistencia cruzada a DDT/piretroides en Sincelejo.  Este trabajo de investigación fue financiado por el Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación - Colciencias en el marco del proyecto de investigación titulado: “Determinación De La Variabilidad Genética Entre Poblaciones De Aedes aegypti, Vector Del Virus Dengue En Colombia” Cód.: 112951929257 Agradecimientos

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65 Frecuencia Haplotipica Resultados y Discusión