Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia.

Presentación del tema: "Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia."— Transcripción de la presentación:

1 Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia Saludo. Agradecemos a los organizadores por su invitación a participar en el seminario. El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de Virología Veterinaria de la UNAL como tesis de maestría en la línea de microbiología y epidemiologia aviar. Cesar Enrique Ventura Politte, MV Maestría Salud Animal Línea de Microbiología y Epidemiologia Aviar

2 CONTENIDO Generalidades de la micoplasmosis
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traqueales Diferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo Hablar de los objetivos del trabajo Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae Conclusiones y Recomendaciones

3 Generalidades de la micoplasmosis
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traqueales Diferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae Conclusiones y Recomendaciones

4 HISTORIA 1898 en bovinos pleuroneumonia
En aves en los años 30- Sinusitis de los pavos en 1938 Años 50, en pollos y pavos-ERC El primer cultivo de micoplasmas en animales fue hecha en bovinos en los años 1900 asociado a cuadros de pleuroneumonía; mientras que en aves por primera vez fueron descritos cuadros respiratorios en pavos en 1905 en Inglaterra, en pollos en 1930 se observo como formas cocobacilares asociados a una coriza infecciosa y en el año 1938 denominaron la enfermedad como la sinusitis de los pavos. Ya para mediados de 1900 se logro el cultivo de micoplasmas aviares de pavos y pollos y se asocio y describió como uno de los componentes de la denominada ERC por diversos autores Nocard y Roux, 1898; Nelson 1935; Dickinson y Hinshaw, 1938; Delaplane y Stuart, 1943;Markham y Wong, 1952; Van Roekel y Olesiuk, 1953

5 ETIOLOGÍA Clase Mollicutes (mollis = suave y cutes = pared),
Orden Mycoplasmatales Familia Mycoplasmataceae Género Mycoplasma 23 especies pueden afectar aves Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma sinoviae, Mycoplasma meleagris y Mycoplasma iowa Los micoplasmas pertenecen a la clase, orden, familia y genero. Son mas de 100 especies de micoplasmas los que se encuentran reportados en la literatura y de los cuales 23 especies pueden afectar a las aves, pero son 4 especies las que principalmente se han asociado a problemas en aves comerciales incluidos pavos, como son MG, MS, MM, MI. Kleven, 2000 Browning & Markhan, 2004

6 GENOMA DE MG kpb, con % de G-C, 740 genes. Funciones claras 469 genes. El genoma de las diferentes especies de mycoplasmas presentan un genoma de entre 600 y 1350 kilopares de bases y se han descrito la presencia de mas de 740 genes, y con funciones especificas ya determinadas para mas de 450 genes en el caso de MG. Papasizi et al., 2003

7 EPIDEMIOLOGÍA Distribución mundial
Problemática de pollos, ponedoras, reproductoras y pavos Aves silvestres y de traspatio La micoplasmosis aviar tiene distribución mundial y es considerada como la enfermedad que mayores perdidas económicas produce a la industria avícola moderna. Las especies de micoplasma de mayor importancia afectan a pollos de engorde, gallinas ponedoras, reproductoras livianas y pesadas y a los pavos. De manera natural algunas especies de aves como codornices, faisanes, palomas, patos, pavos reales pueden presentar infecciones por MG, lo cual constituye un factor de riesgo de gran importancia para la avicultura. OIE, 2004;Kleven, 2006

8 EPIDEMIOLOGÍA Transmisión Horizontal y Vertical Condiciones de granja: alimento, roedores, agua Reservorios y transmisores: Personas, vehículos, Polvo, Insectos y Biofilms Bioseguridad La micoplasmosis puede ser transmitida de manera horizontal entre las aves por medio del contacto directo de animales susceptibles con animales portadoras a través de aerosoles, polvo, plumas, camiones, roedores, agua, personas y en general cualquier elemento que se pueda diseminar por vía aérea. La enfermedad presenta también transmisión de tipo vertical, es decir que se puede transmitir a través del huevo a las progenies. En este sentido han sido aislados micoplasmas de oviductos de hembras afectadas así como de semen de machos afectados. Las medidas de bioseguridad de las granjas modernas tienen una participación importante en el comportamiento de la enfermedad en las diferentes regiones. Kleven, 1996; Christensen, et al., 1994; Butcher, 2008

9 PATOGENICIDAD Citoadhesinas – Hemaglutininas: mgc2, vlhA , GapA , PvpA Perfil antigénico variable Son organismos intracelulares "Latencia " Los micoplasmas poseen algunas genes de importancia en el proceso de adhesión a la célula huésped que les otorga diferente grado de invasividad y patogenicidad, los cuales codifican proteínas que interviene en el proceso inicial de la infección. Algunos de estos y genes tienen como función el alterar sus perfiles antigénicos, lo cual es una de las maneras que tienen los micoplasmas de evadir las respuestas inmunes de los huéspedes. Además de este mecanismo de evasión inmune, esta descrito que los Mollicutes pueden ser organismos intracelulares (bien determinado en insectos) lo cual determina que sean casi invisibles para el sistema inmune, generando los que se puede denominar . Buyuktanir, et al., 2008; Razin, et al., 1998

10 DIAGNÓSTICO IgM 7-10 DPI IgG 15-21 DPI
El diagnostico de la micoplasmosis en general se hace por pruebas serológicas debido tal vez a su fácil acceso y pronta respuesta. Dentro de estas pruebas se encuentra la prueba rápida en placa la cual es una valiosa herramienta tamiz en infecciones tempranas 7-10 DPI y sirve para determinar la exposición de los lotes a los patógenos así como para la evaluación de la seroconversión obtenida por vacunaciones. De otro lado esta la ELISA, la cual es útil para determinar la presencia de IgG a los DPI, por lo cual es una herramienta útil para el seguimiento de las progenies. La prueba de HI puede ser considerada como confirmatoria de las dos anteriores y por ultimo tenemos las pruebas moleculares. IgM 7-10 DPI IgG 15-21 DPI Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008

11 Detección del material genético - ADN
Confirmatoria Serotipificación Detección del material genético - ADN Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008

12 Generalidades de la micoplasmosis
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traqueales Diferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae Conclusiones y Recomendaciones

13 DISTRIBUCIÓN GEOGRAFICA AVICULTURA NACIONAL
63 Granjas de Ponedoras Comerciales – GPC 9,5 % del Censo 145 Lotes 30 Granjas de Reproductoras Pesadas- GRP 33 % del Censo 48 Lotes En el mapa se aprecia la distribución actual de la avicultura en el país según el DANE y FENAVI nacional. El presente estudio tuvo como zona de influencia granjas ubicadas en la zona centro del país, particularmente los departamentos de Cundinamarca y Boyacá. Para el presente estudio se tomaron muestras de todos y cada uno de los lotes de las granjas que después de haber recibido la invitación a participar del trabajo nos permitieron ingresar a sus instalaciones a tomar las muestras. En total fueron muestreadas 63 GPC en las cuales se encontraron un total de 145 lotes de aves, mientras que el total de GRP muestreadas fue de 30 y en ellas se encontraron un total de 48 lotes de aves. Según el numero de granjas reportadas en el censo nacional avícola el presente estudio incluyo el 9,5 % de las GPC y el 33 % de las GRP. MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL DEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO NACIONAL DE ESTADÍSTICA-DANE FEDERACIÓN NACIONAL DE AVICULTORES DE COLOMBIA-FENAVI FONDO NACIONAL AVÍCOLA-FONAV

14 ENCUESTA Ubicación geográfica Tamaño y número de lotes en la granja
Uso de vacunas de MG y MS Edad – Raza – Granjas Cercanas Al momento de realizar la visita de muestreo se lleno una encuesta para cada uno de los lotes muestreados, la cual incluía el geoposicionamiento de las mismas, información general como el tipo de explotación y el tipo de instalación, además de información zootécnica como edad de los lotes, porcentajes de mortalidad, de producción, raza, HAA, conversión alimenticia, numero de lotes presentes, uso de vacunas de MG y/o MS y las medidas de bioseguridad establecidas. Tipo de Explotación y Tipo Instalación Programa de Bioseguridad

15 MATERIALES Y MÉTODOS Enero de 2010 y marzo de 2012. Hisopos traqueales
El tipo de muestra tomado fueron hisopos traqueales para cada uno de los lotes. El muestreo se llevo a cabo entre los meses de enero de 2010 y marzo de 2012.

16 MATERIALES Y MÉTODOS 45 animales por cada uno de los lotes presentes en las granjas Un hisopo humedecido en PBS por cada tres aves. En total fueron tomados 45 aves por cada uno de los lotes, usando un hisopo humedecido en PBS por cada 3 aves

17 MATERIALES Y MÉTODOS Lavado del total de hisopos como un pool.
Conservación en un recipiente estéril a -20 0C Extracción por un procedimiento no fenólico Al llegar al laboratorio el pool de 15 hisopos fue lavado en PBS y los sobrenadantes fueron recuperados y conservados en un tubo estéril libre de DNAasas el cual fue debidamente identificado y conservado a -20 grados. El procedimiento utilizado para la obtención de ADN es un proceso térmico modificado de otros protocolos en el cual se incluyen varios lavados del material en PBS, alternado con procesos de centrifugado a rpm, calentamiento a 100 grados y enfriamiento a -20 grados. Por ultimo el ADN obtenido fue cuantificado por espectrofotometría y almacenado en tubos libres de nucleasas y conservado hasta el momento de su uso en las pruebas de PCR. Modificado de Hernández et al., 2009; OIE, 2008

18 Primers Secuencia Gen Producto
MG-F MG-R 5' CGC AAT TTG GTC CTA ATC CCC AAC A 3' 5' TAAACC CAC CTC CAG CTT TAT TTC C 3' mgc2 237 pb 300 pb MS-F 1 MS-R 1 5´ CCA TTG CTC CTG CTG TTA T 3´ 5´ GAT TCT GTT GTA GTT GCT TCA A 3´ vlhA MS-F 2 MS-R 2 5´ AGT AAC CGA TCC GCT TAA TGC 3´ 5´ GAT GCG TAA AAT AAA AGG AT 3´ 450 pb 28S-F 28S-R 5´ GGC GAA GCC AGA GGA AAC T 3 5´ GAC GAC CGA TTT GCA CGT C 3´ 28S 61 pb Para el montaje de las PCR se utilizaron diferentes juegos de cebadores previamente reportados en la literatura. Para el caso de MG se utilizaron primers que amplifican una región del gen mgc2, el cual nos permite diferenciar de manera directa algunas cepas de MG por el tamaño de amplicon obtenido. para el caso de MS se usaron y compararon dos juegos de primers que amplifican una porción del gen vlhA, con productos de 300 y 450 pb y para el control de la calidad del proceso de la extracción de ADN utilizado se amplifico un housekeeping celular, el cual fue una porción del gen 28S ribosomal a partir de tejidos de pollo. García et al., 2005; Wetzel et al., 2010; Hammond et al., 2009; Suzuki et al., 2009

19 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Estadística descriptiva para las diferentes variables Pruebas de correlación de variables chi cuadrado Pruebas de regresión logística Software estadístico Statistix 8.0 Los datos obtenidos fueron analizados mediante el uso de estadística descriptiva y para determinar la relación de las diferentes variables obtenidas en la encuesta con la presencia o no de los agentes en estudio se utilizaron pruebas de correlación de variables y pruebas de regresión logística mediante el uso del software estadístico.

20 Mycoplasma gallisepticum
POS NEG Cepa F Cepa 6/85 En la presente imagen se muestran los amplificados obtenidos a partir de las muestras de campo para MG. En la primera imagen podemos ver los amplicones obtenidos a partir de los controles de la prueba que fueron usados. El primero corresponde a un control de la Cepa F de MG de 300pb y el segundo a un control de la cepa 6/85 de 237 pb. En la segunda imagen podemos observar los controles positivo y negativo en los carriles 2 y 3 y a partir de allí diferentes muestras de campo. Ninguna de las muestras de campo analizadas mostro el amplicon de cepa 6/85. 300 pb 300 pb

21 Mycoplasma synoviae 300 pb WVU1853 300 pb POS NEG Pb WVU1853 450 pb
Para el caso de MS, los dos juegos de primers fueron consistentes en los resultados para todas las muestras, obteniéndose los amplificados esperados en los dos PCRs. En el primer grafico podemos observar los productos de 300 pb y en el segundo los de 450 pb, en donde se observan los controles positivos que para este caso fue la cepa WVU1853, asi como el control negativo y los productos de las muestras de campo. Del mismo modo se pueden observar amplificados donde se observan 2 bandas o productos claramente definidos. Pb WVU1853 450 pb 500 pb POS NEG

22 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
Cepa 6/85 Cepa F 300 pb 200 pb Para determinar la sensibilidad de cada una de las PCR se utilizaron diluciones en base 10 de cada uno de los controles utilizados en el estudio y de los cuales se conocía la concentración relativa de ADN y se determino el punto hasta el cual se obtenía el amplicon esperado para cada caso. El la figura 1 se muestra la sensibilidad de la prueba para el control cepa F de MG, en la figura 2 para el control de la cepa 6/85 y en la tercera figura la sensibilidad para el control de MS. En cuanto a la especificidad, en el proceso de normalización de las pruebas se utilizaron ADN de diferentes agentes virales y bacterianos encontrándose amplificados únicamente en las reacciones que contenían las cepas control de micoplasma. Cepa WVU1853 Cepa WVU1853 300 pb

23 Alto porcentaje de positividad a MG y MS
Del total de muestras procesadas se encontró que el 69,94 % eran pos a MG y el 48,18 lo eran a MS. Lo que se constituye en el primer hallazgo de importancia en el presente estudio. n : 193

24 Mayor positividad a MS en los dos tipos de explotación
Ya de manera individual para cada uno de los tipos de explotación del estudio, se encontró que para el grupo de GRP el porcentaje de pos a MG fue de 20,8 % y a MS del 45,8 %, mientras que para el grupo de las GPC el porcentaje de positividad a MG fue de 57, 2 % y para MS del 77,9 %. p<0,05

25 Variables sin diferencias estadísticas
GPC Ponedoras comerciales GRP Reproductoras Pesadas Altitud m.s.n.m p>0,05 m.s.n.m p>0,05 Tamaño de los lotes 1000 – aves 770 – aves Departamento Tipo de Instalación Bioseguridad Cumplimiento de 6 parámetros 61,8 % 100 % Al analizar la presentación de positividad para MG y MS para cada uno de los tipos de explotación y su interacción con las diferentes variables relacionadas en las encuestas se encontró:

26 Variables con diferencias estadísticas
GPC GRP Raza 5 Razas p<0,05 en MG 20 – 73 % p<0,05 en MS 60 – 91 % 2 razas p<0,05 en MG 4 – 36 % p<0,05 en MS 39 – 52 % Grupos Etáreos p<0,05 MG 13% al 74 % p<0,05 MS 13 % al 94% p<0,05 MG 17% al 33 % p<0,05 MS 17% al 100% Numero de lotes 1 – 10 p>0,05 en MS p<0,05 para MG 40% - 83% 1 - 3 lotes p>0,05 USO de Vacunas MG y MS 35,2 % MG p>0,05 0% MS 91,7 % MG p>0,05 0 %

27 Mayor positividad mixta en Ponedoras Comerciales
En relación a las infecciones mixtas, para las GRP se encontró un 8,3 % y para las GPC fue del 55,2%. En cuanto a las relaciones con las diferentes variables en estudio, solo se encontraron diferencias significativas entre la presentación de estas y la edad, siendo mayor en los grupos de edad mayor en el grupo de 40 a 60 semanas para ambos tipos de explotación.

28 Generalidades de la micoplasmosis
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traqueales Diferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae Conclusiones y Recomendaciones

29 Sitios de corte HaeIII en el gen mgc2 de MG
Cepas MG Sitios de corte HaeIII en el gen mgc2 de MG Longitud de los Fragmentos Cepa F TCGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAATCCACAGGGTTTTGGTGGCCCAATGCCACCTAACCACATGGGGATGCGGCCAGGGTTTAACCAAATGCCGCCACAAATGGGTGGGATGCCACCTAACCACATGGGGATGCGGCCAGGGTTTAACCAAATGCCACCTAACCAAATGGGTGGAATGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATATGAATCAACCAAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGTCTCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGGTTTAAA 31 pb 53 pb 63 pb 157 pb Cepa 6/85 TCGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCGCAGGGCTTTGGTGGCCCAATGTCACTTAACCAAATGGGGATGCGACCAGGGTTTAACCAAATAGCCCCCACAAATGGGAGGAATAGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATAGCCTAATATGAACCAACCAAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGCGCCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGG 184 pb Cepa R CGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCACAGTGCTTTGGTGGCCCAATGCAACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAGGGTTTAACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCCACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAGGGTTTAACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATATGAACCAACCTAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGTGCCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGGTTTA 52 pb 248 pb Para establecer los patrones de corte, se analizaron de manera virtual las secuencias de las regiones del gen mgc2 de las cepas vacunales y de campo referenciadas en el Genbank buscando los sitios teóricos de corte de algunas endonucleasas. Podemos observar las secuencias de la enzima en amarillo y los fragmentos teóricos generados para cada una de las cepas… Acceso Genbank AY ; AY y AY

30 PCR-RFLP para diferenciar cepas de MG
157 248 184 HaeIII 63 52 53 53 Del análisis anterior se definió trabajar con la enzima HaeIII, la cual de manera grafica corta los diferentes productos del gen mgc2 obtenidos en diferentes fragmentos de acuerdo al tipo de cepa presente. 31 Cepa F Campo 6/85

31 Lectura de Patrones de restricción para M. gallisepticum
La lectura de las digestiones enzimáticas se llevaron a cabo en agarosa, en las cuales se pueden ver 2 diferentes patrones. Explicarlos ROJO: Patrón 1 AMARILLO: Patrón 2

32 Identificación de patrones RFLP de MG con Tinción de plata
Control Cepa F Control Cepa 6/85 Muestra con Patrón 1 Muestra con Patrón 1 Muestra con Patrón 2 300pb 200pb 160pb 100pb 60pb La verificación de los patrones se llevo a cabo en geles de poliacrilamida para determinar la presencia de las diferentes bandas después del proceso de digestión enzimática. Mostrar los marcadores de peso molecular y las cepas vacunales y de campo. 40pb

33 Mayor porcentaje de cepas de campo de MG
Del total de muestras positivas a MG en los dos tipos de explotación se encontró que el 39,8% mostraron un patrón 1 o de cepa vacunal Cepa F y el 60,2 tuvieron un patrón 2 o de cepa de campo. n:93

34 Sin diferencias estadísticas
Patrón 1 Patrón 2 Altura p>0,05 Número de lotes en las granjas Tamaño de los lotes Departamento Bioseguridad cumplimiento de 6 parámetros En relacion a las diferentes variables y la presentacion de cada uno de los patrones se encontro…

35 Con diferencias estadísticas
Patrón 1 Patrón 2 Raza p<0,05 7 – 40 % GPC 2 – 53 % GPC Tipo de Instalación Jaulas 22% - Piso 57% p<0,05 Jaulas 5-9 %- Piso 86 % Tipo de Explotación 30% GPC- 90% GRP 70% GPC- 10 % GRP Explicar las significancia de cada variable

36 Generalidades de la micoplasmosis
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traqueales Diferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae Conclusiones y Recomendaciones

37 Secuenciación de 80 muestras seleccionadas
MG 34 muestras MS 46 muestras Una vez terminada la parte de identificación de las muestras por el PCR y la diferenciación de MG por RFLP, de escogieron un total de 80 muestras para realizar el proceso y análisis de las secuencias de estas. Este proceso de selección tuvo en cuenta incluir muestras de los dos tipos de explotación y principalmente que tuviéramos muestras positivas de el mayor numero de municipios de proveniencia. En total se seleccionaron 34 muestras de MG y 46 de MS. De las muestras de MG 12 presentaron el patrón vacunal por RFLP Y 22 tuvieron el patrón de campo. En cuanto a MS se seleccionaron 36 muestras que amplificaron una sola banda y 10 en las cuales se encontraron dos productos claramente definidos. Patrón 1 12 muestras Patrón 2 22 muestras Única Banda 36 muestras Doble banda 10 muestras

38 Patrón 1 Patrón 2 96-100 % entre ellas 96-100 % Entre ellas
Similaridad de las secuencias de MG Patrón 1 Patrón 2 % Entre ellas % entre ellas 96-98 % cepa R de referencia 96-99% con la Cepa F Los análisis de las secuencia mostraron similaridad entre las cepas del patrón vacunal de entre el 96 y 100 % y del 96 al 99 % con la cepa F. En cuanto a las muestras con el patrón de cepa de campo se encontraron porcentajes de similaridad entre ellas del 96 al 100% y del % con la cepa R de referencia. Cepa F control 98% y 100% Eis7C10 Acceso Genbank AY , HQ , AY

39 Patrón 1 en Muestras de campo
_________________ Patrón 1 en Muestras de campo _________________ _________________ _________________ Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1 Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®

40 Patrón 2 en Muestras de campo
_________________ _________________ _________________ Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10® Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1

41 Similaridad de las secuencias de MS
Se escogieron un grupo de cepas con mas alto porcentaje de similaridad en BLAST 83,2 % - 96,9 % Entre ellas 40-99 % En muestras de doble banda Del grupo de muestras de MS que tuvieron una sola banda se encontraron porcentajes de similaridad de las cepas entre el 83 y el 97 % , mientras al comparar las muestras que presentaron dobles bandas se encontraron porcentajes de similaridad de entre el 40 y el 99%. Genbank HQ ; DQ ; FM ; AB ; FJ

42 Similaridad de las secuencias de MS
Cepa WVU1853 : 38,9 % - 43,8 % Cepa NZMSID181: 82 % – 98 % Cepa B45/04: 88 % - 95 % Para los comparativos con cepas reportadas en el Genbank, se escogió un grupo de 5 con las cuales se observaron los mas altos porcentajes de similaridad después de realizar diversos alineamientos de secuencias utilizando el programa BLAST. Los porcentajes de similaridad con cada una de estas cepas y las muestras del presente estudio fueron de …. Leer Cepa 94011: 89 % - 96 % Cepa EEA: 82 % - 97 % Genbank HQ ; DQ ; FM ; AB ; FJ

43 Productos de MS de una sola banda
_________________ _________________ _________________ _________________ _________________ Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10® Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1

44 Productos de MS de dos bandas
_________________ _________________ _________________ _________________ _________________ Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10® Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1

45 Generalidades de la micoplasmosis
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traqueales Diferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae Conclusiones y Recomendaciones

46 CONCLUSIONES Alta presencia de MG y MS de campo en los dos tipos de explotación en estudio. Mayor presencia en granjas multiedad y mayor edad de los lotes Posibilidad de Transmisión Vertical

47 CONCLUSIONES Infecciones mixtas que afectan el manejo farmacológico y vacunal de lo agentes a nivel de granja Se debe determinar el uso y la importancia del uso de vacunas para el control de la enfermedad en las granjas

48 RECOMENDACIONES Estudios que involucren todas las etapas de producción en los diversos tipos de explotación Evaluación de programas vacunales El mismo tipo de estudio en otras zonas avícolas del país Evaluar interacción de micoplasmas con otros patógenos respiratorios

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