Espectrometría de Masa Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 3 de mayo de 2013

Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, 2002.

4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS Espectrometría de masa 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

Espectrometría de masa 1- Generalidades

separación y determinación de la relación masa/carga de Espectrometría de masa Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos

emisión de energía radiante) Espectrometría de masa Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)

Espectrometría de masa de Biomoléculas Determinación de masa y/o composición: Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos Lípidos  Lipidoma Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar mg-ng (y menos) de material

Espectrometría de masa de Proteínas Determinación de masa y/o composición Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento Niveles de expresión/modificación posttraduccional

Gel 2D de hígado humano http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/

Espectrometría de masa cyt C ~ 12000 Da

Espectrometría de masa biológica Lisozima

Los Iones son importantes Espectrometría de masa Los Iones son importantes En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z: [M+H]+ o [M-H]- De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+) [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]- De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

PM(péptido) = 1162 Da Espectrometría de masa Modo positivo Modo negativo m = +1 +23 +39 -1

Espectrómetro de masa Espectrometría de masa Muestra MALDI TOF ESI Entrada: Volatilización/ Ionización Analizador de masas Detector MALDI ESI TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Sector Magnético Alto Vacío

¿Cómo volatilizar una proteína? Espectrometría de masa ¿Cómo volatilizar una proteína? Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

Espectrómetros de masa Espectrometría de masa Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap FT-MS: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance

Espectrometría de masa 2- MALDI-TOF

Ionización por MALDI: Espectrometría de masa (Matrix assisted Laser desorption/ionization) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra: La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

Espectrometría de masa MALDI-TOF Matriz

Desorción/Ionización por Laser Espectrometría de masa MALDI Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz

t  (m/z)1/2 MALDI-TOF Espectrometría de masa Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t  (m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

MALDI-TOF Ek = zeEs t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2 Espectrometría de masa MALDI-TOF Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: Ek = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek, ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

MALDI-TOF E + - Espectrometría de masa Sin E, iones a la deriva + - Fig. Separación por TOF + + + + s D Detector Fuente ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

Espectrometría de masa Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Carlos Cerveñansky

Espectrometría de masa Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Carlos Cerveñansky

Espectrometría de masa MALDI-TOF

Espectrometría de masa MALDI-TOF Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF

Espectrometría de masa MALDI-TOF

Resolución en MALDI-TOF Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) 1672.92 Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Carlos Cerveñansky

Los Isótopos son importantes Espectrometría de masa Los Isótopos son importantes Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu), se basa en una escala relativa al 126C = 12 amu 1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10-24 g Abundancia isotópica: 12C 12.0000 98.90 % 13C 13.0034 1.10 %

Elemento Masa % 1H 1.0078 99.985 2H 2.0141 0.015 12C 12.0000 98.90 13C 13.0034 1.10 14N 14.0031 99.634 15N 15.0001 0.366 16O 15.9949 99.762 17O 16.9991 0.038 18O 17.9992 0.200 31P 30.9738 100.00 32S 31.9721 95.02 33S 32.9715 0.75 34S 33.9679 4.21 36S 35.9671 0.02 79Br 78.9183 50.69 81Br 80.9163 49.31 Carlos Cerveñansky

Carlos Cerveñansky

Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. 100 5725 5729 5733 5737 5741 5745 Mass (m/z) 2093 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % Intensity Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005] 2xC13 C12 C13 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 ml de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM) Carlos Cerveñansky

Espectrometría de masa MALDI-TOF

Espectrometría de masa 3- ESI-MS

ESI-Q Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization - Quadrupole Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo

Espectrometría de masa ESI N2

Espectrometría de masa ESI

ESI-Q Espectrometría de masa Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar la m/z y realizar un barrido espectral Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

Espectrometría de masa ESI-Q

Espectrometría de masa ESI-Q

Espectrometría de masa ESI-Q

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro 10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro 10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ 10+ 9+ 11+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1)  n = (x2-1)/(x1-x2) n = (1084.1-1) / 72.1 = 15 M = (1156.2 x 15) -15 = 17328

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Mioglobina de caballo

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Bajo PM Alto PM

Espectrometría de masa ESI-MS

Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C

Comparación Espectrometría de masa MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT) Cargas/ion Pocas, en general 1 Muchas Rango de m/z 50000 3000 Rango de masas 200.000 70.000 Interacciones no covalentes No Si MS/MS limitado, PSD Si, CID Acoplar LC Tolerancia a contaminantes