Genoma funcional: Es necesario hacer un estudio funcional del genoma, la predicción de genes no es siempre factible del análisis de sus secuencias solamente. Estudios de mRNA, como permiten los arrays , no son un reflejo directo del contenido de una proteína en la célula

Multiples isoformas de una proteína se pueden generar por procesamiento de RNA. A su vez el mRNA tiene una determinada estabilidad y eficiencia de traducción, y las proteínas pueden estar reguladas por mecanismos post-traduccionales. PROTEOMICA PROTEOMA: Conjunto de PROTEínas expresadas a partir de un genOMA (1990) PROTEOMICA : Es el campo que involucra la identificación, caracterización y cuantificación de proteínas de un tejido o tipo celular

EXPRESION: Permite generar mapas cuantitativos de de las proteínas expresadas en un tipo celular o tejido. - Análisis de co-expresión de las proteínas identificación de caminos biológicos - Efecto de drogas o estímulos biológicos - Identificación de markers para enfermedades LOCALISOMA: mapeo de localización de proteínas - Asignar funciones - Estudio de redes de proteínas PROTEOMICA ESTRUCTURAL : Mapas estructurales y conformación 3D - Relaciones estructura -función - Predicción de estructuras a partir de secuencia - Identificación de ortólogos estructuralmente relacionados PROTEÓMICA

METODOLOGIAS BASICAS Tejidos Libraries de expresión DIRECTAS INDIRECTAS Tejidos Libraries de expresión Células Fracciones Complejos específicas subcelulares Mltiproteicos Identificación de interaccíones prot -prot y proteína ligando - Fago diplay - Pull-down - Doble híbrido Resolución de proteínas : Geles 2D, MALDI , Proteína arrays, Chips Cuantificación , caracterización Bioinformática

GELES 2D y EPECTROMETRÍA DE MASA SEPARACION Y IDENTIFICACION DE PROTEINAS GELES 2D y EPECTROMETRÍA DE MASA Geles 2D (separación por carga y masa molecular), identificar y cuantificar. Muestras de dos situaciones diferentes son analizadas por geles 2D, el análisis y cuantificación se hacen por comparación con el control VENTAJAS DESVENTAJAS - resuelven proteínas que sufrieron modificaciones - Proteínas muy hidrofóbicas no post-traduccionales entran al gel - No resolución de proteínas muy ácidas o muy básicas pI=3 o 10 - No detección de proteínas poco abundantes

Revelado: Plata, proteínas fosforiladas 32P, 33P Analíticos Geles 2D Preparativos o inmunobloting Ejemplo de base de datos para 2D sopts id Higado 2413 138 Humano Riñon 2896 44 Hela 1271 46 nucleolo Otros organismos : Arabidopsis, Dyctiostelium, E. Coli, Levaduras, raton. Base : ExPaSy 2D Identificación: Secuenciación Edman Espectrometría Datos a base de datos Información de las proteínas tipificadas y mapas 2D

ESPECTROMETRIA DE MASA La utilidad de los geles 2D estaba poco aprovechada hasta 1990s, por la dificultad en la identificación de proteínas. A partir de fines de 1980s con MS tecnología, se acoplaron las dos técnicas lo cual permitió una rápida identificación de las proteínas ESPECTROMETRIA DE MASA Componentes básicos: Generador de iones Detector Analizador de masas Generación de iones: MALDI : Matix Assisted Laser Desorption ESI: ElectrSpray Ionization

MALDI Las proteínas se mezclan con una matriz , usualmente orgánica, y se permite que se evapore, y se forman cristales. Sobre la muestra se aplica un pulso de láser, que produce la desorción y carga de la proteína . Matrices

ESI En ESI la muestra de proteína con buffer es hecha spray a través de una pequeña aguja al final de la cual se aplica una diferencia de potencial. El solvente se evapora y las partículas quedan cargadas El spray se produce a partir de una columna de HPLC de fase reversa.

ANALIZADORES DE MASA A) TOF :Típicamente la separación de masas acoplado con MALDI es TOF, separador en base al tiempo de vuelo de la molécula cargada, desde el punto donde se generó y el detector

B) Quadruple analizador de masa : En este caso los iones son transmitidos a través de un campo eléctrico creado por 4 cilindros de metal Puede permitir el paso de todos los iones o solo el paso de ciertos iones con determinada m/z C) ION TRAP: En este caso los iones viajan por un campo eléctrico 3D, en este caso los iones van llegando al detector de a una especie

El análisis de proteínas o péptidos por MS puede ser dividido en dos categorías generales: - Análisis de péptidos o fingerprint mass peptide : las masas de los péptidos individuales en una mezcla son medidos y usados para crear un espectro de masa - Análisis de aminoácidos: conocido como tandem mass spectrometry o MS/MS, es usado para fragmentar un péptido en péptidos mas pequeños para deducir la secuencia de aminoácidos.

Ejemplo Triple quadruple: Para obtener secuencia de aminoácidos En una primera etapa los iones son separados por m/z y transmitidos a un segundo cuádruple, a partir de este se transmite un ion en particular y pasa a la cámara de colisión . En la cámara de colisión el ion es fragmentado por irradiación con un gas inerte Los fragmentos del ion pétidico son luego resueltos en base a su relación m/z en el tercer cuádruple .

FRAGMENTACION Los iones mas comunes que se producen al fragmentarse el péptido son los b o los y según la carga haya quedado retenida en el N-terminal o en el C-terminal

Está graficado intensidad relativa en función de la relación m/z El espectro es interpretado por programas de computadora, los picos del espectro difieren en la masa exacta del aminoácido que les falta. Así se puede ir determinando la secuencia de aminoácidos de un determinado peptido.

Reacción con grupos sulfhidrilo de Cys

APLICACIONES DE MALDI - Identificación de secuencias fosforiladas -Identificación e proteínas : provenientes de complejos proteícos obtenidos por inmunoprecipitación o pull down

Permite el fraccionamiento de una muestra utilizando los principios de cromatografía, la detección de las proteínas se realiza mediante SELDI (semejante a MALDI) Ls Chips para proteínas o Protein chips arrays están preparados con diferentes propiedades cromatográficas : - intercambio anionico o cationico - afinidad por metal - fase reversa, etc

ARRAYS DE PROTEINAS Glass-slides con proteínas unidas covalentemente: (grupos aldehidos reactivos) spots de 150-200 mm, 1600 spots por cm2 - interacciones proteína-proteína - detección de sustratos de quinasas de proteínas -identificación de targets de pequeñas moléculas

Detección de sustratos de proteínas quinasa