RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO
ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE DIVERSIDAD MOLECULAR Problemática: 1. Necesidad de nuevas actividades 2. Métodos basados en la estructura: gran requerimiento Mediante la evolución dirigida pretendemos mimetizar los procesos naturales de selección
Ventajas: 1. Empleo de elevado número de variantes 2. Posibilidad de resumir siglos de evolución en días 3. Amplio uso en biología molecular Inconvenientes: 1. Necesidad de un buen sistema de selección GENERACIÓN DE DIVERSIDAD
Librería (población de individuos) Individuos Identificación Generación de diversidad Selección Análisis Materia origen
EL PROBLEMA DE LA DIVERSIDAD Repertorio natural de Ab Oligonucleótidos degenerados (8 aa´s) 20 8 =2x10 10 Electroporación E. coli 10 9 /µg ADN Librería de phage display 10 8 Librería de ribosome display Librería combinatoriales>10 12
GENERACIÓN DE DIVERSIDAD 1. Mutagénesis química 2. Mutagénesis con cepas hipermutadoras 3. PCR 4. “DNA shuffling” 5. Phage display 6. Ribosomal display
MUTAGÉNESIS QUÍMICA * Mutágeno: EMS, HA,... * Supervivencia: 0,1-10% CEPAS HIPERMUTADORAS * E. coli XLI-red (mutD mutS mutT) PCR * Taq pol: error 1/10000 por ciclo * sales de manganeso * nucleótidos desbalanceados
“DNA SHUFFLING”
The structure of Fabs
Antigen binding by CDRs in scFvs
Expression of antibody fragments in E. coli V H C H1 V L C L Anchor-protein IM P Fab OM V H V L NH 2 NH 2 C H1 C L SS COO - COO - Fab
Expression of antibody fragments in E. coli Anchor-protein V H V L linker OM IM P scFv NH 2 V H V L COO -
Massive cloning of V-genes by PCR B-cells cDNA PCR mRNA Spleen Hybridoma Blood Combinatorial synthesis
Assembly of V genes as scFvs VH fragmentsVL fragmentsLinker Homology driven amplification Sfi I Not I
Assembly of V genes as scFvs
The filamentous phages: M13 life cycle
The protein gp3 of M13phage
Cloning of scFv genes into phagemids bla Sfi INot I ColE1 oriM13 ori gene 3 VHVL (Ap r ) pCANTAB-5E plac scFv pIII M13 phage pVIII coat Phagemid DNA
scFv-SELECTION MIMICS THE IMMUNE SYSTEM Antigen Infect E. coli ** Amplification ** Binding ** Phab library ** Expression of scFv Elution
ARM (RIBOSOME) DISPLAY