Generación de anticuerpos de dominio único de alpacas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades hepáticas. Investigador Postdoctoral: Yenisey Alfonso.

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1 Generación de anticuerpos de dominio único de alpacas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades hepáticas. Investigador Postdoctoral: Yenisey Alfonso Fernández Investigador Principal: José R. Espinoza Babilón Correspondencia: Dr. José R. Espinoza, jose.espinoza@upch.pejose.espinoza@upch.pe Unidad de Biotecnología Molecular, Universidad Peruana Cayetano Heredia Lima, marzo 2016 Contrato N°: 01-2013-Fondecyt-Financiamiento de Subvención para Investigación

2 Fascioliasis 17 millones infectados, 180 millones en riesgo. Impacto veterinario y humano Diagnóstico (E/S, FAS 2) Tratamiento (Resistencia: Australia, Irlanda, España. Brasil, Argentina, Perú) URGENTE: Novedosas formas de diagnóstico y tratamiento Nanocuerpos (VHH) Alta afinidad, especificidad, solubilidad. Fácil producción Nanopartículas Demostrada aplicabilidad Actividad fotocatalítica 1-100nm Especificidad TiO2 Fasciola hepática Radicales Muerte celular

3 Objetivos General: Generar un conjunto de anticuerpos de alta afinidad y especificidad anti -E/S de F. hepática útiles para el diagnóstico y tratamiento de la fascioliasis. Específicos: Generar bibliotecas de cDNA de nanocuerpos enfocados en antígenos específicos anti-E/S de F. hepática. Caracterizar estructural y funcionalmente los anticuerpos de alta afinidad y especificidad anti-E/S de F. hepática. Evaluar la letalidad de los nanocuerpos de alta especificidad y afinidad anti-E/S conjugados con nanopartículas de TiO2 contra F. hepática.

4 1) Generación de las bibliotecas 2) Caracterización de los nanocuerpos 3) Evaluación de su letalidad Generación de las bibliotecas Transformantes Autoligados Secuenciación E/S Fas 2 PBMC ARN cDNA PCR VHH Transformación en E. coli Inmunización Clonaje Phen 2 Phage display Tamizaje de clones específicos Phage Elisa Sub Clonaje pet 22b+ Expresión en Bl21 Purificación Elisa TiO2 Conjugación Optimización Elisa Evaluación en muestras clínicas Identificación blancos reconocidos (E/S) Evaluación de su fotoletalidad “in vitro”

5 Resultados (Inmunización) Fig 1. Producción de anticuerpos IgG en una alpaca inmunizada con E/S Absorbancia a 450nm Tiempo (semanas) Fig 2. Producción de anticuerpos IgG en una alpaca inmunizada con Fas 2 E/S Fas 2

6 Resultados Generación de las bibliotecas (Estimación del tamaño) Transformantes: 1x10 7 Autoligados <0.5% Bibl E/S Transformantes: 1,2x10 8 Autoligados: <1% Bibl Fas 2 ARN cDNA PCR ligación y transformación Chequeo de transformantes y estimación del tamaño Fig 3. Patrón de amplificación para transformantes de la Bib E/S Fig 4. Patrón de amplificación para transformantes de la Bib Fas 2

7 Selección específica: 50 clones Resultados (Selección de anticuerpos específicos e inmunoreactividad) Panning [Fas 2] (µg) lavados Total de fagos rescatados 1 1 10 1,6x10 9 20,8155,3x10 9 30,5201,1x10 12 Tabla2. Selección de fagos portadores de fragmentos VHH que reconocen la proteína Fas 2 Tabla1. Selección de fagos portadores de fragmentos VHH que reconocen antígenos de E/S. Selección específica: 82 clones Panning [E/S] (µg) lavados Total de fagos rescatos 11104x10 5 20.8158x10 6 30.6201.5x10 7 E/SFas 2 Fig 5. Reactividad de fagos producidos por 36/50 clones evaluados frente al antígeno de interés (E/S) empleando como control un antígeno irrelevante. Fig 6. Reactividad de fagos producidos por 38/82 clones evaluados frente al antígeno de interés (Fas 2) empleando como control un antígeno irrelevante.

8 Fas 2: 5 Grupos de VHHs diferentes E/S: 15 grupos de VHHs diferentes Resultados (secuenciación) Fig 7. Secuencias de proteínas (CDRs) obtenidas para clones productores de fragmentos de anticuerpos específicos para E/S y fas 2. CDR1 CDR2CDR3

9 Resultados (Expresión y evaluación de la inmunoreactividad) 1)Clonaje en un vector de expresión y purificación a pequeña escala 15,7 kDa 14 20 15,7 MM 2) Evaluación de la inmunoreactividad 3) Producción a mayor escala 5) Bioconjugación con nanopartículas de TiO2 6) Evaluación de la fotoletalidad E/S ???? v v v v v Fas 2 TiO2

10 Conclusión Se ha establecido una plataforma de producción de VHHs recombinantes de alpacas, que reconocen moléculas de interés biomédico y representan nuevos blancos de estudio para el desarrollo de tecnologías diagnósticas y nuevas alternativas terapéuticas de alta eficacia contra fascioliasis.

11 Impactos Impacto en ciencia y tecnología: El presente trabajo supone una aproximación a novedosos sistemas de diagnóstico y tratamiento de la fascioliasis (nuevos sistemas de detección y estandarización de métodos de conjugación de nanopartículas y nanocuerpos con posibles aplicaciones terapéuticas para la muerte selectiva del parásito). Impacto económico: El uso de nanocuerpos conjugados a TiO2 como nuevos agentes para direccionar un ataque selectivo y específico al parásito pudieran tener un importante efecto fasciolicida. Poder contar con nuevas formas diagnósticas y terapéuticas, que supongan la mejora de las existentes, pudiera representar un pronóstico confiable y una mejor calidad de vida, contribuyendo a un ahorro considerable de recursos en la atención al paciente y conjuntamente reduciendo los costes indirectos relacionados con la enfermedad. Impacto social: La generación de nuevas herramientas de diagnóstico y tratamiento para el control de la infección por F. hepática constituye una demanda social prioritaria para las poblaciones más afectadas por fascioliasis.

12 Eventos Congreso Científico Internacional del Centro Nacional de Investigaciones Científicas de Cuba. Habana, 2015 Publicaciones Se prevé la escritura de dos publicaciones

13 Gestión del proyecto y sostenibilidad RUBROPRESUPUESTADOEJECUTADOSALDO INGRESOS 267040.00246040.0021000.00 EGRESOS Pasaje de posdoctorado5040.002740.332299.67 Seguro médico y de accidente6000.002740.333259.67 Subvención por manutención posdoc144000.0096000.0048000.00 Gastos de investigación60000.0042137.3917862.61 Subvención a investigador principal42000.0021000.00 Overhead UPCH10000.005000.00 Total Egresos267040.00169618.0597421.95 Saldo0.00 76421.95

14 Limitaciones Subvención Visa y tramites legales Agradecimientos Los autores agradecen a Concytec por el financiamiento recibido para el desarrollo del proyecto y la beca postdoctoral otorgada (Nº 01-2013-Concytec- Fondecyt).

15 Gracias