Tutorial de Uso Metamorph: Configuración básica de una MACRO de captura Unidad de Microscopia

2 Abrir macro: APPS>>Multi Dimensional Acquition Para configurar nuestra sesión de trabajo debemos abrir desde el menú general del Metamorph el comando: APSS >>MULTI DIMENSIONAL ACQUISITION De este modo accederemos a una“macro”(guía básica) para configurar las condiciones básicas de nuestro experimento Abrir Guía de Configuración

3 Configurar macro:MAIN Apartado MAIN En este primer apartado seleccionamos todas las aplicaciones que queremos realizar en nuestra sesión de trabajo: -Timelapse(Series Temporales) y/o - Z Series (Series en Z) Las opciones que podemos configurar son: TIMELAPSE:para realizar Series Temporales MULTIPLE STAGE POSITIONS:permite introducir más de un único punto de muestreo. Es posible configurar múltiples puntos de muestreo en cada porta y/o placa de cultivos. MULTIPLE WAVELENGHTS:nos permite introducir más de un único canal de fluorescencia. Es posible configurar hasta 6 canales :5 filtros de fluorescencia + luz transmitida Z SERIES:para realizar Series Z

4 Configurar Guardado archivos: SAVING Apartado SAVING Nos permite dar nombre a los archivos de las capturas y seleccionar una carpeta de guardado de los archivos (1)-En”Description” podemos introducir una extensa descripción del experimento y/o datos de interés que quedarán grabados y asociados a todos los archivos de captura. (2)-”Select directory”Cada laboratorio tiene asociada una carpeta para guardar las capturas de sus sesiones. Se accede a ella desde “Mis documentos”>>Usuarios imágenes. (3)-”Increment base name if file exists”.Es necesario activar SIEMPRE esta casilla para que el programa nos guarde automáticamente las diferentes capturas. (4)-”Base name”:introducimos el nombre con el que se guardarán las capturas.

5 Configurar Series temporales:TIMELAPSE Apartado TIMELAPSE Nos permite definir la duración total del experimento y los intervalos a los que se producirá la captura Debemos configurar 2 parámetros : (1)-TIME INTERVAL : introducimos el tiempo entre capturas (en milisegundos,segundos,minutos u horas). (2)-DURATION: introducimos la duración total del experimento (en segundos,minutos u horas). (3)-NUMBER OF TIME POINTS.En función de los intervalos de captura y la duración total del experimento el programa nos calcula e indica el número total de puntos que tomará en la serie

6 Configurar puntos muestreo:STAGE Apartado STAGE Nos permite introducir múltiples posiciones de muestreo. ¿Cómo? (1)-El programa conserva los puntos grabados en la última macro configurada, lo primero que hay que hacer es borrar estos puntos : pinchamos en cada uno de ellos y eliminamos clicando con la cruz roja. (2)-Buscamos y enfocamos una posición y la nombramos en POSITION LABEL. (3)-Grabamos la posición clicando en la flecha negra. MUY IMPORTANTE: Para introducir nuevos puntos repetimos el proceso SOLO recordar que es necesario introducir un nuevo nombre (position label) antes de grabar el nuevo punto, de otro modo, borraremos el punto anterior al sobreescribirlo

7 Configurar número de canales:WAVELENGHTS Apartado WAVELENGHTS En este primer apartado debemos definir el número de canales/marcadores que vamos a utilizar y que deberemos configurar uno a uno. Es posible configurar hasta 6 canales: -5 filtros de fluorescencia: -GFP -YFP -Cy3 -Cy5 -Dapi -Luz Transmitida normal

8 Configurar canales:WAVELENGHTS Apartado WAVELENGHTS Una vez seleccionado el número de canales es necesario configurar cada uno por separado optimizando el valor de los tiempos de exposición ¿Cómo? (1)Illumination: Introducimos el filtro en su versión “cámara”:(existen 2 variantes para cada filtro: “binocular” y “cámara”) (2)Exposure: Es FUNDAMENTAL optimizar el tiempo de exposición para cada canal, para ello abrimos y capturamos una imagen simple en el modo”ACQUIRE”, anotamos el valor más optimo de exposición y lo introducimos en la macro. (3)El resto de parámetros deben mantenerse intactos : Auto expose: NEVER Acquire: EVERY TIME POINT Autofocus: NEVER (4) La opción” Z series with the wavelenght” SÓLO debe estar activada para realizar Z Series (no en timelaspse)

9 Configurar Series Z :MODO 1 Apartado Z SERIES. Modo 1_Range around Current (1)-Enfocamos la preparación en el punto de interés, la posición del enfoque se muestra en “CURRENT POSITION”. (2)-Activamos la casilla “RANGE AROUND CURRENT. (3)-Introducimos el grosor de las secciones en “STEP SIZE”(0,5 ó 1 micras son adecuados). (4)-Introducimos en “RANGE” el número de Z que hará (en igual número ) por encima y por debajo del plano enfocado

10 Configurar Series Z: MODO 2 Apartado Z SERIES Modo 2_Ajuste manual (1)-Enfocamos la preparación en el punto de interés, la posición del enfoque se muestra en “CURRENT POSITION”. (2)-Desactivamos la casilla “RANGE AROUND CURRENT y automáticamente SE ACTIVAN las casillas TOP // BOTTOM (3)-Pasamos a modo Visión VIDEO y delimitamos los extremos (superior e inferior)(top y bottom)desplazándonos con el micrómetro. (4)-Introducimos el grosor de las secciones en “STEP SIZE”(0,5 ó 1 micras son adecuados)

11 Configurar visionado capturas:DISPLAY Apartado DISPLAY Permite configurar el modo de visionado de las capturas en pantalla. 2 opciones: DEFAULT: Configurada por defecto, permite visualizar en pantalla las capturas a medida que están se van realizando. MINIMIZE IMAGES DURING ACQUISITION: No muestra en pantalla las capturas.

12 Configuración macro:SUMMARY Apartado SUMMARY Genera un sumario con toda la información detallada sobre las condiciones configuradas para el inicio de la captura. De interés el dato del tamaño en disco duro que ocupará el trabajo

13 Capturando imágenes Capturando imagenes (1)-Una vez que iniciamos la captura en las condiciones configuradas se pasa a un modo visión en el que el programa nos muestra las capturas separadas por canales (filtros de fluorescencia). (2)-Acompañado de un visor que nos informa del estado exacto de la captura : punto de muestreo, tiempo de muestreo, segundos restantes para la siguiente captura) 1 2

Configuración básica de una MACRO de captura. -Abrir macro: APPS>>Multi Dimensional Acquition Configurar macro:MAIN Configurar Guardado archivos: SAVING Configurar Series temporales:TIMELAPSE Configurar puntos muestreo:STAGE Configurar número de canales:WAVELENGHTS Configurar canales:WAVELENGHTS Configurar Series Z :MODO Configurar Series Z: MODO Configurar visionado capturas:DISPLAY Configurar macro-sumario:SUMMARY Capturando imágenes

15 Unidad de Microscopía Centro de Investigación del Cáncer Campus Miguel de Unamuno Salamanca (Spain)