SEMINARIO DE INVESTIGACIÓN Presenta: GUILLERMO MEZQUITA MACIAS Médico Internista - Endocrinólogo Diplomado en Metodología de la Investigación TUTORA: DRA. IVONE OLIVARES CORICHI UNIVERSIDAD ANAHUAC

PROTOCOLO DE TESIS Orlistat vs Placebo. Efecto en la cantidad de grasa hepática por histopatología en ratas Zucker

OMS Cifras mundiales: 400,000,000 de obesos. 1.6 Billones de sobrepesos en el mundo (x2 al 2015) 80 % padecen Hígado Graso No Alcohólico. 50 % son niños. 20,000,000 niños con sobrepeso < 5 años. 25 % evolucionan a Cirrosis Hepática en 10 años. Al momento del diagnóstico, el hígado tiene > 5% de grasa. Prevalencia: 57.5 - 75% Japón: en edad de 4-12 años, USG reportó 2.6%

NHANES III 12-18 años, 3% presentan ALT elevada. Edad promedio de presentación: 11.6 a 13.5 años. Se ha detectado desde los 2 años de edad. Hepatomegalia asintomática. Prevalencia: Tanner IV 47 %. Tanner II y III 36 %. Tanner I 33% Guzzaloni G, et al.Int J Obes Relat Metab Disord 2000; 24: 772-76

San Diego, California e Italia. Autopsias: 10.5 % niños 7.4 % niñas Existen marcadores clínicos, bioquímicos y paraclínicos. Guzzaloni G, et al.Int J Obes Relat Metab Disord 2000; 24: 772-76. Kahen T, et al. Gastroenterology 2004;126:A753-4.

Tamaulipas. 15.2 % tuvo Hipertensión Arterial Sistémica Estudio transversal en niños obesos (> percentila 85 IMC) Edades entre 2 y 18 años. 95.7 % se concentró en la percentila > 95 15.2 % tuvo Hipertensión Arterial Sistémica Esteatosis Hepática (USG) = 28.3 %.

Tamaulipas. Niños con Esteatosis: IMC = 34.54 +/- 4.52 CT = 196.7 +/- 59.7 Cintura = 106 +/- 11.43 HOMA = 12.0 +/- 7.3 Insulina Ayuno = 51.5 +/- 31 ALT = 65.4 +/- 32.5 AST = 41.1 +/- 26.1 QUICKI= 0.271 GGT = 39.2 +/- 26.3

No Alcohólicos (Toronto) «Autopsias» 18.5% esteato-hepatitis, autopsias, obesos. 2.7% no obesos. 13.8% fibrosis grave en obesos graves. 6.6% fibrosis grave en delgados. Wanless IR, et al. Fatty liver hepatitis (NASH) and obesity: an autopsy study wit h analysis of risk factors. Hepatology.1990;12(5):1106-10.

NHANES 1999-2004. ALT , marcador de daño hepático. CAUCÁSICOS 7.4 % México-Americanos Hombres Mujeres 11.5 % 12.4 % 3.5 % Negros 6 % Hombres vs Mujeres RR 7.7 (IC 95% 3.9-15.1) México-Americanos vs caucásicos RR 1.6 (IC 95% 1-2.6)

Obesidad, Diabetes, Infusiones de glucosa generan hiperinsulinemia, Inhibición de la oxidación de ácidos grasos. Obesidad y pérdida de peso presentan Ac. Grasos al hígado. Wanless IR, et al. Fatty liver hepatitis (NASH) and obesity: an autopsy study wit h analysis of risk factors. Hepatology.1990;12(5):1106-10.

HÍGADO GRASO Hace 15 años era considerado una enfermedad rara. hace 10 años «manifestación de resistencia a la insulina» RI + Hiperinsulinemia. Etiología del Hígado graso No Alcohólico. La acumulación de Triglicéridos es primordial en la etiología. El HGNA es la manifestación hepática del SM. Qing Liu, Stig Bengmark and Shen Qu.Lipids Health Dis. 2010 Apr 28;9:42

Mecanismos: Inflamación, esteatosis y RI. El HGNA evoluciona a fibrosis y cirrosis 20% y en 9% falla hepática o carcinoma hepatocelular 1%. Mecanismos: Inflamación, esteatosis y RI. 1º: esteatosis hepatocelular; 2º: HGNA. Las gotas de grasa son de triglicéridos. Qing Liu, Stig Bengmark and Shen Qu. Lipids Health Dis. 2010 Apr 28;9:42

Contribución de Ácidos Grasos No Esterificados (AGNE) Qing Liu, Stig Bengmark and Shen Qu.Lipids Health Dis. 2010 Apr 28;9:42 Pre-prandial Pos-prandial AGNE Circulantes 81% 61% AGNE Dieta 10% 26% Ac. Grasos NOVO 7% 9%

No se sabe si la resistencia a la insulina es causa de esteatosis o la esteatosis es causa de resistencia a la insulina. La resistencia a la insulina periférica (muscular) es causa de 80-90% de alteración de la captura de glucosa. En tejido adiposo induce un efecto anti-lipólisis por la insulina e incremento en la liberación de AGNE. Qing Liu, Stig Bengmark and Shen Qu.Lipids Health Dis. 2010 Apr 28;9:42

Una dieta alta en grasa causa 3 veces más acúmulo de grasa Una dieta alta en grasa causa 3 veces más acúmulo de grasa en el hígado en el corto plazo. Aclaramiento de insulina correlaciona directo con el contenido de grasa hepática, e inverso con la sensibilidad de la insulina hepática. Qing Liu, Stig Bengmark and Shen Qu.Lipids Health Dis. 2010 Apr 28;9:42

n= 144 sin fibrosis 37 (26%) Fibrosis leve 53 (37%) Fibrosis moderada Angulo P, Keach JC, et al. Independent predictor of liver fibrosis in patientes with NASH. Hepatology.1999;30(6):1356-62. sin fibrosis 37 (26%) Fibrosis leve 53 (37%) Fibrosis moderada 15 (10%) Fibrosis en puentes 14 (10%) Cirrosis 25 (17%)

Predictores de fibrosis grave por A. multivariado Angulo P, Keach JC, et al. Independent predictor of liver fibrosis in patientes with NASH. Hepatology.1999;30(6):1356-62. edad mayor P = 0.001 Obesidad P = 0.002 Diabetes mellitus P = 0.009 AST / ALT > 1 P = 0.03 IMC P = 0.003

551 pacientes, cirugía bariátrica y SM: biopsia trans- operatoria. Marceau P, et al.Liver pathology and the metabolic syndrome X in severe obesity. J Clin Endocrinol Metab.1999;84(5):1513-7. ESTEATOSIS 86% FIBROSIS 74% INFLAMACIÓN 24% CIRROSIS 2%

104 Mujeres, misma Cohorte Cintura y Glucemia en ayuno fueron directamente proporcional y aditivo para desarrollar esteatosis hepática 371 Mujeres del mismo estudio: A mayor número de componentes de SM, mayor riesgo de Esteatosis H. Pacientes con DM o ITG tuvieron un RR=8.0 para fibrosis hepática. Marceau P, et al.Liver pathology and the metabolic syndrome X in severe obesity. J Clin Endocrinol Metab.1999;84(5):1513-7.

Diabetes, Esteatosis, Edad = Indicadores Significativos de Cirrosis. Diabetes, Cintura, Glucosa de Ayuno alterada e IMC = Mayor riesgo para esteatosis hepática con alto riesgo de desarrollar fibrosis. Diabetes, Esteatosis, Edad = Indicadores Significativos de Cirrosis. Marceau P, et al. Liver pathology and the metabolic syndrome X in severe obesity. J Clin Endocrinol Metab.1999;84(5):1513-7.

OBESIDAD ABDOMINAL (CINTURA) Triglicéridos (mg/dL) Componentes Diagnósticos del Síndrome Metabólico Alonso A, Murguía M, et al. Waist perimeter cutoff points and prediction of MS. Arch Criterio Diagnóstico Cifra Según IDF (2005) OBESIDAD ABDOMINAL (CINTURA) > 90 cm H; > = 80 M Triglicéridos (mg/dL) > 150 o Tx. C-HDL (mg/dL) < 40 H; < 50 M o Tx. T/A > = 130/85 o Tx. Nivel de Glucosa > 100 mg o Tx.

A mayor intensidad de la EHNA, mayor expresión de estos receptores. Pacientes con EHNA y Esteatosis Simple cursan con TNF- alfa e IL-6 elevadas. EHNA se diferencia de por mayores niveles del receptor soluble tipo 1 de TNF-alfa y del receptor soluble de IL-6. A mayor intensidad de la EHNA, mayor expresión de estos receptores. TNF-alfa genera Necroinflamación y Resist. Insulínica (RI) Liu et al. Lipids in Health and Disease 2010, 9:42

La Grasa causa RI por activación de serin-cinasas. Las 3 mas importantes son: Jun N-terminal Cinasa, Inhibidor del NF-Kb (NF-kB) cinasa (IKK). Nueva isoforma de Proteín-Cinasa C. JNK e IKK son potentes moléculas de señales pro- inflamatorias. Ácidos grasos y dieta alta en grasas pueden inducir señales inflamatorias, en ausencia de obesidad o RI, a través de receptores TLR4. Liu et al. Lipids in Health and Disease 2010, 9:42

Histología y Evolución de NAFLD. Yeh MM, Brunt EM. Pathologyof Nonalcoholic fatty liver disease. Am J Clin Pathol.2007;128(5):837- 47. CATEGORIA HISTOLOGÍA EVOLUCIÓN TIPO 1 Esteatosis No Progresiva Tipo 2 Esteatosis e Inflamación lobular Curso Benigno Tipo 3 Esteatosis, Inflamación lobular y degeneración vesicular Esteatohepatitis no alcohólica, sin fibrosis, progresa a cirrosis Tipo 4 Esteatosis, degeneración en vesículas con c. Mallory y/o fibrosis Esteatohepatitis No Alcohólica, con fibrosis progresa a cirrosis

HIGADO GRASO

HIGADO GRASO

HIGADO GRASO

ESTEATOHEPATITIS NO ALCOHOLICA

ESTEATOHEPATITIS NO ALCOHOLICA

ESTEATOHEPATITIS NO ALCOHOLICA

CLASIFICACIÓN HISTOLÓGICA DE NAFLD Brunt EM, et al. AJG1999;22:1714-19. INFLMACIÓN HEPÁTICA FIBROSIS HEPÁTICA 0 = AUSENCIA DE INFLAMACIÓN 0 = AUSENCIA DE FIBROSIS 1 = INFLAMACIÓN PORTAL LEVE 1 = FIBROSIS LEVE 2 = INFLAMACIÓN LEVE A MODERADA 2 = LEVE + PERIPORTAL 3 = INFLAMACIÓN > GRADO 2 3 = + PUENTES FIBROSOS 4 = CIRROSIS

ESTEATOHEPATITIS NO ALCOHOLICA

CIRROSIS HEPÁTICA NO ALCOHLICA

ORLISTAT (TETRAHIDROLIPSTATINA) INHIBIDOR SELECTIVO DE LIPASAS PANCREÁTICAS Y GASTRO- INTESTINALES. Rev Med Liege. 1999 Mar;54(3):192-6. APROBADO POR LA FDA PARA OBESIDAD (2000) REDUCE LA ABSORCIÓN DE LIPIDOS EN UN 30% (200 Cal apx) CITOSTÁTICO Y CITOTÓXICO PARA CELS. TUMORALES. INHIBE EL DOMINIO DE LA TIOESTERASA DE LA SINTETASA DE ÁCIDOS GRASOS (SAG) Drugs Today (Barc). 1999 Feb;35(2):139-45. FASEB J. 2006 Oct;20(12):2027-35.

ORLISTAT (TETRAHIDROLIPSTATINA) PACIENTES QUE DISMINUYEN AL MENOS 9% DE SU PESO INICIAL EN TRATAMIENTO MUESTRAN MEJORÍA HISTOLÓGICA DE SU HÍGADO. Hepatology. 2009 Jan;49(1):80-6. ESTUDIO CON 14 PACIENTES. OBESOS + NASH. BIOPSIA PRE- Y 6 MESES POST-TRATAMIENTO 120 mg tid. 70% REDUCCIÓN DE GRASA. 28% MEJORÓ 2 GRADOS DE INFLAMACIÓN. 50% MEJORÓ 1 GRADO. 22% SIN CAMBIOS. 35% REAPARECIÓ INFLAMACIÓN. 21% MEJORÓ 2 GRADOS DE FIBROSIS. 50% MEJORÓ 1 GRADO DE FIBROSIS. 28% SIN CAMBIOS. Dig Dis Sci. 2007 Oct;52(10):2512-9. Epub 2007 Apr 3.

Orlistat vs Atorvastatina, Ezetimiba y Fenofibrato en estudios independientes y combinado Orlistat combinado ha mostrado significativamente mayor reducción de los componentes de Hígado Graso y SiMet. Mejora fibrosis de la esteato-hepatitis. La reducción de peso con Orlistat incluído, de mas del 9% mejora la histología del hígado. El plus en el tratamiento lo ha determinado el tipo de fármaco combinado. World J Hepatol. Filippatos TD, et al. 2010 April 27;2(4):139-42.

Estudio XENDOS (4 años de seguimiento) 37.3% menos riesgo de DM-2. 45 % menos DM-2 en ITG al inicio del estudo. Orlistat 8/153 nuevos casos vs 17/156 en placebo. Mejora la actividad de ALT y esteatosis por USG. Mayor reducción en Colesterol total y LDL. Efectos adversos: Esteatorrea, meteorismo, proctorrea, vitamina-K. Vascular Health and Risk Management 2007:3(6) 817–821

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Uno de los factores fisiopatológicos en el desarrollo de hígado graso es la cantidad de ácidos grasos libres que son absorbidos en el tubo digestivo durante la alimentación cotidiana y la presentación de estos al hígado.

JUSTIFICACIÓN El hígado graso evoluciona a esteato-hepatitis, cirrosis y carcinoma en distintas proporciones. Es una patología en ascenso epidemiológico. La dieta nacional no cambiará en los próximos 30 años. > 320,000,000 de Hígado graso en el mudo. >120,000,000 de ellos son niños. > 1.6 billones de adultos con sobrepeso (3.2 para el 2015) Hace 10 años Orlistat fue aprobado para manejo de Obesidad.

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ¿Alimentar ratas Zucker con mayor contenido de grasa y bloquear su absorción parcialmente con un inhibidor de la lipasa pancreática en el intestino modifica la cantidad de grasa depositada en el hepatocito?

HIPOTESIS Ho: Tratar a las ratas con Orlistat no modifica la cantidad de grasa depositada en el hepatocito. H1: Tratar a las ratas con Orlistat ocasiona diferencias en la cantidad de grasa depositada en el hepatocito.

OBJETIVO PRIMARIO Evaluar las diferencias en la cantidad de grasa depositada entre el grupo de ratas tratadas con Orlistat y el grupo placebo.

DISEÑO DEL ESTUDIO. EXPERIMENTAL, PROBABILÍSTICO, EN RATAS MACHO, CON ASIGNACIÓN SIMPLE, COMPARATIVO, CONTROLADO, CONCURRENTE, LONGITUDINAL, PROSPECTIVO, CIEGO.

MATERIAL Y MÉTODOS RATAS DE LINEAJE ZUCKER (20) BIOTERIO C/ JAULAS, AMBIENTE CONTROLADO ALIMENTO RICO EN ÁCIDOS GRASOS (INCREMENTO 50%) ORLISTAT () AGUA EQUIPO DE DISECCIÓN, CAJAS DE PETRI PARA HÍGADO, FORMOL, JERINGAS, PORTA-OBJETOS, TINCIÓN P/HÍGADO PAPELERÍA.

MATERIAL Y MÉTODOS Alimentación rica en ácidos grasos. Control de Temperatura, Peso y Luminosidad. Agua a libre demanda. Aplicación del medicamento en el agua. Sacrificio del animal a los 4-6 meses de tratamiento.

TAMAÑO DE MUESTRA 20 ratas Zucker. 10 ratas para recibir Orlistat. 10 ratas control

VARIABLES Inflamación hepática. (PRESENCIA / AUSENCIA) Grasa Hepática (porcentaje) Tipo y Grado (I a IV) Inflamación hepática. (PRESENCIA / AUSENCIA) Fibrosis hepática (PRESENCIA / AUSENCIA) Cirrosis hepática (PRESENCIA / AUSENCIA)

ANÁLISIS ESTADÍSTICO Estadística Avanzada: Estadística Descriptiva: media, mediana, determinación de normalidad de la curva muestral mediante de p de sesgo, curtosis y Kolmogorov-Smirnof. Estadística Avanzada: Correlación de Spearman para peso hepático y corporal. U de Mann-Witney para variables anormales independientes categóricas. X2 Exacta de Fisher para comparación de tratamientos.

SELECCIÓN Y AISGNACIÓN ANÁLISIS DE RESULTADOS CRONOGRAMA MES 1 MES 2 MES 3 MES 4 MES 5 MES 6 MES 7 MES 8 SELECCIÓN Y AISGNACIÓN INICIA EL EXPERIMENTO EXPERIMENTO EXPERIMENTO / Corss-Over SACRIFICIO ANÁLISIS DE RESULTADOS