Reparación del DNA

Daño al DNA puede ocasionar mutaciones Los daños en el DNA son minimizados por sistemas que los reconocen y corrigen Daño al DNA SISTEMA DE REPARACIÓN EXITOSO Sin consecuencias Daño al DNA SISTEMA DE REPARACIÓN X MUTACIÓN

Daños espontáneos al DNA Sitios AP 5000-10000 al día inestable 100 al día

Desaminación: pueden generar “hot spots” C-G T-A

Tautómeros

Daños inducidos al DNA La metil guanosina se aparea de forma incorrecta con la timina causando un cambio de G-C a T-A Radiaciones ionizantes: rayos X pueden causar rompimiento en el DNA

MECANISMOS DE REPARACION 1- Sistemas de Reparación directos Enzimas que revierten directamente el daño. Por estos mecanismos se reparan: metilación de guanina, y en algunos vertebrados dímeros de pirimidína. No intervienen nucleasas ni ADN-polimerasas. Fotoreactivación (ruptura de los dímeros de pirimidinas por acción de una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible).

Reparación Fotoreactivación

Desmetilación

2- Sistemas de Reparación Indirecta Hay intervención de nucleasas y ADN-polimerasas. Se necesita de la hebra “molde” perteneciente al mismo cromosoma o al homólogo. Reparación por Escisión (BER , NER, MMR) Reparación de nucleótidos (NER) aislados por lesión UV: necesita la otra hebra como templado (hasta 30 bp). Intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD. Además de foto productos, repara lesiones voluminosas (bulky) que distorsionan la conformación del dúplex y que obstaculizarían la transcripción y replicación. Reparación de bases modificadas (BER).- Repara casos de alteraciones puntuales en bases nitrogenadas (lesiones NO voluminosas) producidas por alquilación, oxidación o desaminación. Se origina un “sitio AP” y luego se retira el nucleótido “AP” y se re sintetiza la hebra)

2) Reparación Indrecta de Daño al DNA Reparación por escisión de Bases (BER) 1) Iniciado por DNA glicosilasa específica reconoce el daño, corta la unión glicosílica entre base y azúcar y se forma el sitio AP 2) Sitio AP reconocido por AP endonucleasa (corte 5’ de AP). 3) Fosfodiesterasa (corte 3’). 4) DNA polimerasa rellena el gap DNApol I (E.coli), DNA pol  (mamíferos). 5) DNA ligasa 2) Reparación Indrecta de Daño al DNA

Reparación por escisión de Nucleótidos (NER) Escinucleasa uvrABC realiza este tipo de reparación en dímeros de timina, otros fotoproductos y bases dañadas. Escinucleasa (246 kDa) está compuesta por tres subunidades (A, B y C) UvrA (dímero con actividad de ATPasa) se une al DNA en la región dañada. UvrB/UvrC tienen actividad de endonucleasa y corta en los lados adyacentes de la cadena liberando un oligonucleótido La región “vacía” es rellenada por una DNA polimerasa I y sellada por una DNA ligasa. UvrD E.coliSistema Uvr ABC: Remoción de 12nt EucariontesRemoción de 24-29 nt

 Reparación post- replicativa Reparación del apareamiento (MMR) (“mismatch repair”): Su principal tarea es remover bases mal aparadas y pequeños “loops” introducidos por inserciones / deleciones durante la replicación Reduce los errores de replicación de 10-7 a 10-10 pb / replicación

Reparación de bases mal apareadas(MMR) E.coli genes mut S, L, H Reemplaza hasta 1kb Metilación diferencial (dam, dcm) MutS reconoce el mismatch MutH distingue ambas cadenas Corte en GATC en la cadena no metilada Mut L coordina actividad de Mut S y H En eucariotas homólogos de proteínas Mut

… Reparación post- replicativa Recombinación Homóloga (HR) Reparación de ambas cadenas Usa ADN homólogo como templado y es altamente exacto Más activo durante la Fase S y G2 Unión de extremos no homólogos (NHEJ) No usa ADN templado y generalmente se pierden algunos nucleótidos. Más activo en la Fase G1

Mecanismos de reparación cuando las dos cadenas se dañan

NHEJ en bacterias

NHEJ en bacterias

polIV Respuesta SOS polII Pol V

Mecanismos de Reparación en Eucariontes

Mecanismos de reparación en Eucariontes (NER) Participan > de 25 proteínas Reconoce el daño 3 síndromes XP-B XP-D Helicasas que forman parte de TFIIH Abre las cadenas XP-A confirma la presencia del daño XP-G; XP-F endonucleasas Corrige el error

XPA-XPG CSA y CSB

ATM: vía de transducción de señales

Recombinación homóloga Recombinación no homóloga

Recombinación homóloga Recombinación entre cromátidas hermanas Recombinación entre cromosomas homólogos

El modelo Holliday (a) pair of chromatids (b) a single strand cut is made in each chromatid (c) strand exchange takes place between the chromatids (d) ligation occurs yielding two completely intact DNA molecules

Uniones Holliday

Uniones Holliday

Resolución de las uniones Holliday Holliday junction

El modelo de Holliday explica la conversión genética

El modelo Meselson-Radding

El modelo de Meselson-Radding

El modelo de la cadena doble fragmentada

Vía RecBCD Subsequently, it was shown that mutations that inactivate the recB or recC gene lead to defects in conjugational, transductional, and phage recombination; a loss of SOS induction; sensitivity to DNA-damaging agents that cause DSBs; and low cell viability as being a physical component of the “RecBC” holoenzyme required for the exonuclease activity (7, 37, 105, 178). This late discovery was, in part, due to the complexity of interpreting the recD phenotype. In contrast to the recB and recC phenotypes, recD cells are fully viable, are resistant to DNA-damaging agents, and display hyperrecombinogenic behavior

Secuencia Chi Estimula la recombinación en forma direccional 5´-GCTGGTGG-3´ Octámero sobre-representado en el genoma de E. coli. Existen aprox 1,008 sitios Chi. Aparecen en promedio cada 4.5 kpb. 75% de los sitios Chi están orientados hacia el origen de la replicación

RecBCD 134 kDa 129 kDa Rec B es una ATPasa dependiente de DNAy una helicasa que opera en direccion 3´--5´. Rec B interacciona con RecC para formar una helicasa rapida y procesiva. El dominio de nucleasa puede funcionar como endo o exo. Este dominio interacciona con RecA. Existe muy poco trabajo bioquimico sobre RecC. Sola no tiene ninguna actividad pero unida a RecB estimula la actividad de ATPasa y helicasa. Mutantes en RecC alteran el reconocimiento de la secuencia Chi. RecD ha sido dificil de estudiar porque se purifica de manera insoluble y la que es soluble no tiene actividad. Experimentos renaturalizando la proteína muestran que tiene una actividad de ATPasa dependiente de DNA de cadena sencilla y una actividad de helicasa 5´---3´. 67 kDa

Translocación bipolar RecD RecB Inactivacion de cualquiera de las dos helicasas, disminuyen la velocidad de desenrrollamiento entre 2 y 3 veces. = velocidad ≠ velocidad

3´ Vía RecBCD 5´ Ocasionalmente + frecuente

Vía RecBCD

Proteína RecA 37kDa Aprox 8,000 a 10,000 Aumenta a 70,000 en SOS 3 nucleótidos/monómero que se extiende en dirección 5´--3´

Enzimas bacterianas que catalizan la recombinación RecA Intercambio de cadenas de DNA RuvA, B Migración de los entrecruces. RuvA es tetramérica y tiene alta afinidad por HJ independiente de la secuencia. RuvB es hexamérica y tiene afinidad por DNA. Tiene actividad de ATPasa que es estimulada por unión a RuvA. RuvC Nucleasa resuelve entrecruzamientos

Proteínas RuvA,RuvB

Resolvasa RuvC Homodímero de 19kDa

Reparación por recombinación

Reparación post-replicativa