Tema 4 REPARACIÓN DEL DNA Lesiones del DNA. Origen de las mutaciones

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1 Tema 4 REPARACIÓN DEL DNA Lesiones del DNA. Origen de las mutaciones
Mecanismos de reparación Reparación directa del daño: DNA fotoliasas Escisión de la región dañada seguida de remplazamiento preciso Escisión de base Escisión de nucleótido Reparación de errores de replicación Desapareamientos (“mismatch repair”: MMR) Translesión (“by-pass”) Reparación de roturas de doble cadena Unión de extremos no-homólogos Unión de extremos homólogos: recombinación homóloga Papel de la proteína p53 Enfermedades asociadas con defectos en la reparación del DNA

2 Estos ataques espontáneos producen despurinaciones y desaminaciones
DAÑOS DEL DNA Errores en la replicación del DNA Ataques expontáneos Ataques hidrolíticos Daño oxidativo Metilaciones descontroladas Estos ataques espontáneos producen despurinaciones y desaminaciones Agentes químicos externos: CARCINÓGENOS Son compuestos con grupos electrófilos que reaccionan con O y N Modifican las bases nitrogenadas Pro-carcinógenos: su metabolismo en el organismo mediante el citocromo P450 los transforma en carcinógenos Agentes físicos: radiaciones Luz UV: dímeros de timina (dímeros de pirimidinas) Radiaciones g : rotura de la doble cadena del DNA

3 Lesiones del DNA que requieren reparación
Lesión del DNA Causa Pérdida de una base Eliminación de purinas por ácidos y calor (en el genoma humano, hidrólisis espontánea de enlaces glucosídicos/día ) Base alterada Radiaciones ionizantes, agentes alquilantes, especies reactivas de oxígeno (ROS: O2-., HO., H2O2) Base incorrecta Desaminación espontánea (C pasa a U y A pasa a hipoxantina), errores en la replicación no corregidos por exo 3’-5’) Deleción/Inserción Agentes intercalantes (naranja de acridina, proflavina) Dímeros de pirimidina Radiación UV Rotura de las cadenas Radiación ionizante, agentes químicos (bleomicina)

4 Alteraciones espontáneas que requieren reparación del DNA
DAÑOS DEL DNA Alteraciones espontáneas que requieren reparación del DNA oxidación hidrólisis metilación no controlada Estas alteraciones conducen a la despurinación o desaminación de la doble cadena de DNA El tamaño de las flechas indica la frecuencia relativa de cada acontecimiento Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

5 Despurinación y Desaminación
Sitio apurínico Sitio apurínico Otras desaminaciones (menos frecuentes) A  Hipoxantina G  Xantina Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

6 Desaminación de bases adenina hipoxantina guanina xantina citosina
uracilo 5-metil citosina timina timina no hay desaminación Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

7 Mutaciones producidas por desaminación
Cambio de apareamiento G=C por A=T; transición Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

8 Mutaciones producidas por desaminación
La desaminación de C y A origina TRANSICIONES, mutaciones puntuales producidas por la sustitución de una purina (pirimidina) por otra. G  A ; C  T citosina uracilo adenina hipoxantina transición  T = A CG a TA  G  C AT a GC

9 Mutaciones producidas por despurinación
Azúcar despurinado (A) Deleción de 1 par de bases (Ej. AT) Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

10 La radiación UV produce dímeros de timina
La luz UV une de forma covalente dos residuos de timina adyacentes en una hebra cadena de DNA, formando ciclobutano Los dímeros de timina producen una distorsión local del DNA Con menos frecuencia se pueden formar otros dímeros de pirimidinas T-T > T-C, C-T > C-C Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

11 Oxidación de bases El metabolismo celular expone el DNA a los efectos perjudiciales de las especies reactivas de oxígeno (ROS: O2-., HO., H2O2), subproductos naturales del metabolismo oxidativo. Se conocen más de 100 modificaciones oxidativas diferentes en el DNA. p. Ej.: G puede oxidarse a 8-oxoguanina oxoG puede aparearse con C o con A. Si oxoG se con A se produce una TRANSVERSIÓN. TRANSVERSIÓN: mutación puntual producida por la sustitución de una purina por una pirimidina o al revés. G  C  T =A

12 Alquilación de bases Agentes alquilantes
Puede aparearse con C o T, produciendo transversiones La alquilación de la posición N7 de un nucleótido de purina, hace que su enlace glucosídico sea susceptible a la hidrólisis y lleve a la pérdida de la base: despurinación

13 Sistemas de reparación del DNA
Escisión de la región dañada seguida de remplazamiento preciso Escisión de base Escisión de nucleótidos Reparación de errores de replicación Desapareamientos (“mismatch repair”) Translesión (“by-pass”) Reparación de roturas de doble cadena Unión de extremos no-homólogos Unión de extremos homólogos: recombinación homóloga

14 Reparación por escisión
Etapas principales Reconocer la lesión Eliminar la lesión escindiendo parte de una de las hebras Nueva síntesis para llenar el hueco Sellar la mella para reestablecer la continuidad del DNA Reparación por escisión de base Una glucosilasa elimina la base, deja la cadena intacta La AP endonucleasa corta la cadena, la AP liasa elimina el azúcar La DNA polimerasa rellena el hueco La DNA ligasa sella la mella Reparación por escisión de nucleótido Un corte doble elimina la lesión, se elimina un oligonucleótido (12-13 nucleótidos en E. Coli, en humanos) La DNA polimerasa rellena el hueco La DNA ligasa sella la mella

15 Reparación por escisión de base
DNA glucosilasa: hidroliza el enlace -glucosídico que une la base dañada al azúcar. Existen al menos 6 tipos de gluocosilasas (reconocen desaminaciones de C y A; bases oxidadas o alquiladas; bases con anillos alterados, etc…) “UNG” Genera un sitio sin base: apurínico o apirimidínico. Sitio AP AP endonucleasa: rompe el enlace fosfodiéster del sitio AP gererado por la glucosilasa Sistema de replicación: DNA polimerasa I y DNA ligasa Fig 5-50a .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

16 Reparación por escisión de base
En humanos La desaminación de 5-metil-C (habituales en secuencias CG) deja T en lugar de U, actúan glucosilasas que reconocen el par desapareado T:G, eliminando preferentemente la T, sin embargo a veces elimina la G, produciendo una mutación. La AP endonucleasa más importante es APE1 Corta la cadena por el lado 5’ del sitio AP Recluta la DNA pol b La DNA pol b, que tiene dos actividades enzimáticas, elimina el fosfato-azúcar abásico, con su actividad AP liasa, y rellena el hueco con su actividad polimerasa

17 Reparación por escisión de base
G Reparación por escisión de base C El sistema de reparación por escisión de base repara los daños en el DNA producidos por despurinación de bases, a partir de AP endonucleasa Despurinación de G G C C G Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col. (modificada) C

18 Reparación por escisión de nucleótido
Este sistema de reparación actúa sobre una gran variedad de lesiones Dímeros de pirimidina Modificaciones químicas con carcinógenos: benzopireno, aflatoxina y con agentes quimioterápicos como cisplatino Bases desapareadas y pequeños lazos del DNA Es el sistema de reparación más genérico y flexible

19 Reparación por escisión de nucleótido
De forma general este sistema implica: Detección del daño: mecanismo de “escaneo” Actividad endonucleasa: ESCINUCLEASA DNA helicasa Sistema de replicación: DNA polimerasa y DNA ligasa Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

20 Reparación por escisión de nucleótido
Sistemas enzimáticos en E. Coli: 4 componentes Función Componente Escaneo DNA UvrA Nucleasa: ESCINUCLEASA UvrB, UvrC Helicasa UvrD Sistema de replicación DNApol I/DNApol II; ligasa

21 Reparación por escisión de nucleótido (E. Coli)
Fig Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.

22 Reparación por escisión de nucleótido
Comparación en E. Coli y en humanos Función E. Coli Humanos Escaneo DNA UvrA XPA, XPC; RPA Nucleasa: ESCINUCLEASA UvrB, UvrC XPF, XPG Helicasa UvrD XPB, XPD Sistema de replicación DNApol I/DNApol II; ligasa DNApol d/e; ligasa

23 Reparación por escisión de nucleótido en humanos
Gen humano Función de la proteína XPA Proteína de reconocimiento del daño (interacción con DNA lesionado) XPB DNA helicasa, subunidad de TFIIH XPC Reconocimiento inicial de la lesión. Interacción con TFIIH XPD XPF Actividad nucleasa (5’lesión) XPG Actividad nucleasa (3’ lesión) ERCC1 Unión a XPF y a proteína RPA RPA Unión al complejo XPF-ERCC1 (reconocimiento de lesión junto a XPA)

24 Reparación por escisión de nucleótido
en humanos Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.

25 Reparación por escisión de nucleótido en humanos
En eucariotas superiores este tipo de reparación es más activa en genes transcripcionalmente activos Reparación asociada a transcripción XERODERMIA PIGMENTOSA Trastorno asociado al sistema de reparación por escisión de nucleótidos Síntomas: Fotosensibilidad Elevada predisposición a padecer cáncer de piel

26 Sistema de replicación DNApol III; ligasa
Reparación de desapareamientos post-replicativos o apareamiento incorrecto de base o MisMatch Repair (MMR) Enzimas MMR en E. Coli: 4 componentes Función Componente Escaneo DNA MutS Reparación de errores MutL MutH (endonucleasa) MutU (UvrD helicasa) Sistema de replicación DNApol III; ligasa

27 Reparación de desapareamientos post-replicativos (MMR)
¿Cómo se reconoce la cadena dañada? El sistema tiene que distinguir la base errónea en la cadena hija, sin afectar a la cadena molde Sistema MMR La cadena hija permanece sin metilar en las secuencias GATC varios minutos después de su síntesis Fig Genes VII., Lewis.

28 Reparación de desapareamientos
(E. Coli) Los apareamientos incorrectos son reconocidos por un homodímero MutS, al que se une MutL Los 2 monómeros MutS crean un bucle que contiene el apareamiento incorrecto La endonucleasa MutH se une a sitios hemimetilados, permanece inactiva hasta que interacciona con el complejo MutL- MutS MutH corta la hebra hemimetilada, del lado 5’ ó 3’ del desapareamiento Fig Lehninger 3ª ed

29 Reparación de desapareamientos
(E. Coli) (cont.) MutS MutL MutH Exo VII o RecJ (5’ a 3’ exo) Exo I o Exo X (3’ a 5’ exo) MutS, MutL MutU (helicasa) Hueco de  1000 nucleótidos DNA pol III SSB DNA pol III SSB Fig Lehninger 3ª ed (Modificada)

30 Reparación de desapareamientos
Comparación de los sistemas enzimáticos en E. Coli y en humanos Función E. Coli Humanos Escaneo DNA MutS hMSH2-hMSH6 Reparación de errores MutL MutH (endonucleasa) MutU (UvrD helicasa) hMLH1-PMS1, PMS2 MED1 (endonucleasa) Sistema de replicación DNApol III; ligasa DNApol d/e; ligasa

31 Reparación de desapareamientos
(En humanos) ¿Cómo se distingue la cadena hija en humanos? No determinado, pero intervienen Las secuencias CG metiladas Las mellas transitorias de los fragmentos de OKAZAKI DNApol d/e; ligasa Fig Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.

32 Reparación de desapareamientos y Cáncer
El mal funcionamiento del sistema de reparación de desapareamientos post-replicativo MMR) predispone al CÁNCER de COLON Cáncer de colon no poliposo hereditario (HNPCC) Enfermedad autosómica dominante Causas: defectos de MLH1, MSH2 o PMS2

33 Reparación por síntesis de translesión “trans lesion synthesis” (TLS)
¿Qué ocurre si la DNA pol de replicación encuentra una lesión, dímero de T o un sitio AP, que no ha sido reparada? Actúa un mecanismo de seguridad que permite que la maquinaria de replicación se salte “by –pass” estos sitios de lesión Síntesis de translesión Este sistema es muy propenso a cometer errores, pero evita que un cromosoma se replique de manera incompleta

34 Reparación por síntesis de translesión (TLS)
Polimerasas de translesión: Familia Y de DNA polimerasas Sintetizan DNA a través del sitio de la lesión Son dependientes de molde Incorporan nucleótidos de una manera independiente de apareamiento de bases, por eso cometen errores con frecuencia E. Coli Fig Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.

35 Reparación de roturas de doble cadena
Las roturas de doble cadena son potencialmente letales Causas de rotura de doble hebra Radiaciones ionizantes (rayos g, rayos X) Especies de oxígeno reactivas Quimioterápicos (bleomicina)

36 Unión de extremos no-homólogos
DNA-PK: Proteína quinasa dependiente de DNA Proteína KU: ATPasa dependiente de DNA con actividad helicasa KU desenrrolla los extremos del molde hasta que regiones muy cortas (2-6 pb) puedan aparearse p. ej.: nucleasas; eliminan los extremos no apareados Se eliminan pb Fig Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.

37 Unión de extremos homólogos: recombinación homóloga
ATM: proteína quinasa activada por rotura de cadena doble RAD51: conduce el apareamiento de DNA homólogos e invasión de cadenas Un filamento nucleoproteíco busca la secuencia homóloga de DNA doble sobre la cromátida hermana

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39 La proteína p53 detiene el ciclo celular si el DNA está dañado
Fig Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

40 La quinasa ATM activa p53 Fig Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.

41 Enfermedades asociadas con alteraciónes en el sistema de reparación por unión de extremos homólogos
ANEMIA DE FANCONI Síntomas: Anomalías de desarrollo (infertilidad, deformidades esqueleto) Anemia Elevada predisposición a padecer leucemia mieloide CÁNCER DE MAMA HEREDITARIO Por deficiencia en BRCA-1 y BRCA-2 ATAXIA TELANGIECTASIA Inestabilidad genómica, Disfuncióin del sistema inmune Predisposición a padecer linfomas, leucemias. Producida por alteraciones en la proteína quinasa ATM

42 Biología Celular y Molecular 5ª ed., Lodish y col.