TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo

Interacción de proteínas: Doble híbrido en células de levaduras

pAD

pBD

Plásmidos reporteros

Interacción de proteínas: Doble híbrido en células de mamífero

pBIND

pACT

pG5/luc

Ejemplo de resultados

Enriquecimiento de transfectantes Cell sorting Cotransfectando con vectores de expresión para GFP o proteínas de membrana que sean reconocidas por Ac-fluorescentes

Transfección estable Por integración Por recombinación homóloga Como episoma Requiere de un marcador de selección en el vector Util para estudios que impliquen inducción de la expresión

Marcadores de selección eucariontes Agent Action Marker Gene Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase Hygromycin B proteica Gen hyg o hph Puromycin G-418 Neomycin phosphotransferase Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase

Marcadores de selección G418 (Geneticina) Bloquea la traducción La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor ) Para células de mamífero, plantas y levaduras Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Cliva el DNA - El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)

Sistema reprimible por tetraciclina

Sistema inducible por tetraciclina

Vector de expresión del regulador

Vector de expresión del regulador

Vector de clonado del gen de interés

Vector de expresión para dos genes regulados por tet

Vector episomal

Sistema de recombinación homóloga Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae Sitio FRT (Flp recombination target) Recombinasa Flp

Vector que contiene el sitio FRT

Pasos de recombinación homóloga 1- Generar línea que posea el sitio FRT

Vector de clonado del gen de interés

Vector de clonado del gen de interés

Vector de expresión de la recombinasa

2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa

Resultado

Disminuir expresión de un gen Ribozimas cDNA aaaaa --------auucg--------ccguuua---- ----uaagc-- ggcaaau---- ribozima Clivado del mRNA blanco

Disminuir expresión de un gen Antisentido 1-Oligonucleótido pequeño simple cadena (15 -25 bases) gttagccggggaagcaaat ----------------caaucggccccuucguuua---- aaaaa Degradación por RNAsa del híbrido RNA/DNA

2- Síntesis de un RNA antisentido complementario al gen blanco. cDNA a’ b’ c’ aaaaaa 5’ 3’ mRNA a b c Degradación por RNAsa del híbrido RNA/RNA

Disminuir expresión de un gen

Síntesis in vitro • Síntesis química • Transcripción in vitro • Digestión de los dsRNA por RNase III/DICER Expression in vivo • Plásmidos • Templados para PCR (cassette de expresión siRNA) • Vectores virales

RNAi (siRNA) ----------------caaucggccccuucguuua---- aaaaa Síntesis mRNA Síntesis guuagccggggaagcaaau auuugcuuccccggcuaac RNAi (30 a 50 nucleotidos) b) cDNA Procesados por la maquinaria celular (dicer…) Degradación por RNAsa Clivado del mRNA blanco

Estrategias siRNA

Expresión de siRNA in vivo Promotor/Enhancer • Pol III (U6, H1) • Pol II (CMV) Secuencia de terminación • Pol III: string of 3-5 T’s) Señal de poly(A) SV40 siRNA Templado Templado para cadenas sense , hairpin y antisense del siRNA

Vector siRNA

Vectores Plasmídicos Expresión transiente • No se trabaja con RNA • Produce gran cantidad de vector • Enriquecimiento de células transfectadas por sorting o selección Expresión Estable (marcadores de selección) • Produce líneas estables • Animales transgénicos

Vectores múltiples siRNA

Vectores múltiples siRNA

Control siRNA

Bibliotecas siRNA

Diseño del experimento

Diseño del experimento

Bibliotecas siRNA: ejemplo

Bibliotecas siRNA: ejemplo

Bibliotecas siRNA: ejemplo