en proteómica dirigida SpHPP SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida Servicio de Proteómica - Centro Nacional de Biotecnología Manuel Lombardía Uría

Síntesis de péptidos para estudios de proteómica dirigida Fases: Selección y diseño de los péptidos para cada proteina de interés: proceso esencial para el éxito de los experimentos SRM/MRM selección basada en criterios empíricos y teóricos obtención de péptidos proteotípicos óptimos Síntesis química Validación experimental de los péptidos : - previa a la síntesis de los péptidos pesados

Selección de péptidos Proteínas de interés

Proteínas asignadas Known Unknown Protein Accession number Name P02795 MT2_HUMAN Metallothionein-2 Q96M29 TEKT5_HUMAN Tektin-5 Q58EX7 PKHG4_HUMAN Puratrophin-1 Q96MC5 CP045_HUMAN Uncharacterized protein C16orf45 Q01726 MSHR_HUMAN Melanocyte-stimulating hormone receptor Q14028 CNGB1_HUMAN Cyclic nucleotide-gated cation channel beta-1 Q14764 MVP_HUMAN Major vault protein P23975 SC6A2_HUMAN Sodium-dependent noradrenaline transporter Q0VD83 APOBR_HUMAN Apolipoprotein B receptor Q8NC67 NETO2_HUMAN Neuropilin and tolloid-like protein 2 Q6EMK4 VASN_HUMAN Vasorin Q8IZ96 CKLF1_HUMAN CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing protein 1 O14983 AT2A1_HUMAN Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 1 P33527 MRP1_HUMAN Multidrug resistance-associated protein 1 P22695 QCR2_HUMAN Cytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial P60510 PP4C_HUMAN Serine/threonine-protein phosphatase 4 catalytic subunit P55287 CAD11_HUMAN Cadherin-11 Q49A26 GLYR1_HUMAN Putative oxidoreductase GLYR1 Q4KMP7 TB10B_HUMAN TBC1 domain family member 10B Q14019 COTL1_HUMAN Coactosin-like protein Q9NXV2 KCTD5_HUMAN BTB/POZ domain-containing protein KCTD5 Q9Y221 NIP7_HUMAN 60S ribosome subunit biogenesis protein NIP7 homolog P55259 GP2_HUMAN Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 O75150 BRE1B_HUMAN E3 ubiquitin-protein ligase BRE1B Q2VPK5 CTU2_HUMAN Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 2 Q8N9N5 BANP_HUMAN Protein BANP

Selección de péptidos Proteínas de interés Predicción de PTP Evidencia experimental Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio Predicción de PTP Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”

Selección de péptidos Proteínas de interés Predicción de PTP Evidencia experimental Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio Predicción de PTP Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico” Selección de péptidos

Criterios de selección de péptidos Únicos para una proteína particular: Búsqueda en Uniprot/Swiss prot (BLAST) 3 a 4 péptidos por proteína No missed cleavages Longitud entre 6 y 20 aa Baja hidrofobicidad: valor de 10 a 40 según algoritmo SSRCalc (sequence specific retention calculator) Evitar aa susceptibles de modificación química - M y W son fácilmente oxidables - N seguida de G ó P tiende a desamidarse - Q y E en N term suelen transformarse en piroglutámico - C en N term tiende a ciclarse si está carbamidometilada - N en N term es dificil de liberar durante la síntesis del péptido - D junto con G, P ó S favorece la rúptura de la cadena a pH bajo - AA ácido en posición P2 ó P2’ promueven missed cleavage

Selección de péptidos Proteínas de interés Predicción de PTP Evidencia experimental Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio Predicción de PTP Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico” Selección de péptidos Búsqueda de evidencias en BD No todos los péptidos posibles son observados experimentalmente. Seleccionar péptidos más frecuentemente observados en repositorios del tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas

Selección de péptidos Proteínas de interés Predicción de PTP Evidencia experimental Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio Predicción de PTP Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico” Selección de péptidos Búsqueda de evidencias en BD No todos los péptidos posibles son observados experimentalmente. Seleccionar péptidos más frecuentemente observados en repositorios del tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas SINTESIS DE PEPTIDOS

Síntesis de péptidos Aparato: Sintetizador automatizado Multipep de Intavis AG Método: Síntesis en fase sólida (SPPS) sobre resinas de polímeros mediante química FMOC (grupo protector del amino) Formatos: placas 96 minicolumnas con filtro con capacidad para 1-10 µmol Purificación de los péptidos crudos por HPLC semipreparativo Uso de resinas unidas a Lys ó Arg pesadas (13C y 15N) para péptidos pesados Cuantificación de péptidos pesados purificados por análisis de aa ó por espectroscopía fluorescencia (kit comercial)

SINTESIS DE PEPTIDOS PESADOS Validación de péptidos Péptidos sintetizados crudos ó purificados Verificación del péptido por MALDI-TOF MS Validación mediante experimentos LC-MS/MS y SRM/MRM Péptidos proteotípicos óptimos SINTESIS DE PEPTIDOS PESADOS

Péptido 1 crudo Péptido 1 purificado

Péptido 1 crudo Péptido 1 purificado

Péptido 3 crudo Péptido 3 purificado

Péptido 4 crudo Péptido 4 purificado

Péptidos sintetizados

Conclusión Podemos concluir de estos resultados que nuestro método de síntesis es apropiado para la producción de un gran número de péptidos en cantidad y calidad aceptable para su uso en proteómica dirigida.