TECNICAS PARA ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS
ELECTROFORESIS La electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa, permite separar fragmentos de DNA de diferente tamaño. Sin embargo, no se puede saber en cuál de los fragmentos se encuentra el gen o la secuencia de DNA que se busca.
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
El DNA puede sufrir un proceso reversible de separación y reasociación de hebras DNA en estado nativo Denaturado Renaturado
Acido nucleico inmovilizado Sonda marcada Acido nucleico inmovilizado
Paso 1: Separación de fragmentos de RNA por electroforesis.
Paso 2: Transferencia del RNA al filtro o membrana
Acido nucleico inmovilizado Paso 3: Hibridación con la sonda específica complementaria Sonda marcada Acido nucleico inmovilizado
Paso 4: Lavado y detección de la sonda marcada
La hibridación con sondas específicas permite determinar la identidad de un fragmento de DNA o RNA
La hibridación en condiciones de mayor estringencia garantiza una mayor especificidad en la interacción.
TIPOS DE HIBRIDACION Tipo de interaccion: DNA – DNA / DNA – RNA/ RNA – RNA Hibridación en filtro: Southern Northern Colony Hibridization Dot-blot 3. Hibridacion en solución : substractiva + columna de hidroxiapatita 4. Hibridacion in situ
Colony hibridization Por hibridación en colonia, se puede identificar cuáles de las colonias recombinantes obtenidas, tiene clonado un fragmento de DNA en particular.
SECUENCIAMIENTO Uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs) 4 reacciones por separado, en paralelo. Separación de fragmentos producidos por electroforesis en gel de secuenciamiento Animación (Lodish)
Se realizan 4 reacciones por separado Oligonucleótido o Primer Templado Figure 7-29a