CONSERVACIÓN Y CONTROL DE CEPAS MICROBIANAS

Colección de Cultivo y servicio que ofrece ¿Qué son las Colecciones de Cultivo? - Son organizaciones que principalmente se ocupan de guardar convenientemente cepas de microorganismos,células superiores o diversos materiales biológicos y los suministran, previa petición,a laboratorios microbiológicos o de biología celular. - Son por lo tanto servicios de apoyo a los trabajos de microbiología

¿Cuándo aparecieron las primeras colecciones de cultivo? -Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catálogo -La más antigua Lobaina (Belgica) (Hongos) -La ATCC,en 1925.No vinculos directos con la Universidad,es de carácter comercial (Manassas,USA). -La CECT,nace en el CSIC(Villanueva)(1960). -PRCC ,Profesor J.L.Ramos (Pseudomonas putida) A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional denominada World Federation for Culture Collection (WFCC). En Europa a su vez estan agrupadas en la “European Culture Colletion Organization (ECCO) que se fundó en 1982.

Servicios que prestan las Colecciones de Cultivos 1.-Recolección,conservación y suministro de cepas microbianas. -Recolección: Es el servicio mas típico de una CC.Las colecciones reunen cepas que les llegan a traves de distintos conductos,las conservan convenientemente y las suministra previa petición. -Conservación: -Suministro: Se hace por correo de superficie,aéreo o mensa- jería,pero siempre empaquetado correctamente (tres envueltas) siempre hay que considerarlo como material “potencialmente patógeno” 2.-Recopilación de datos de las cepas microbianas y difusió de los mismos Fichas,ordenadores,redes electronicas,public.de catálogos

3.-Servicio de guardería de las cepas microbianas Se pueden guardar por encargo cepas microbianas,cobrando una tasa anual y manteniendo el secreto de este depósito. 4.-Identificaciones microbianas. 5.-Depósito de cepas microbianas. -Depósito público: Cualquier microbiólogo puede depositar una cepa, que considere interesante,en la colección. Esta cepa se incorpora en el catálogo y puede suministrarsela a cualquier otro microbiólogo que la solicite. -Depósito no público:Algunas CC reciben el nombramiento de Autoridad Internacional de Depósito para fines de patentes,de esta manera se garantiza la descripción total y reproducción del proceso patentado. Una vez conseguida la patente,la cepa puede suministrarse previa autorización escrita del propietario,aunque no figure en el catálogo.

6.-Organización de Cursos 7.-Investigación. 8.-Asesoramiento en general

Normas generales para la conservación de cepas microbianas Los tres objetivos para una correcta conservación: 1.-Mantenimiento en Cultivo puro.(PUREZA) 2.-Que este viva.(VIABILIDAD) 3.-La cepa debe guardarse geneticamente estable(ESTABILIDAD) Lapage en 1977 decía que: Un cultivo inicial de una especie es una población Un subcultivo es una población diferente derivada de este cultivo inicial. c) Una cepa es una suceción de subcultivos del cultivo inicial

¿los datos del cultivo inicial seran los mismos en la cepa? NO necesariamente porque se producen cambios en los subcultivos Los métodos en la conservación de las cepas microbianas tienen Como objeto fundamental minimizar estos cambios

La conservación de cepas microbianas Método de elección o de conservación a largo plazo Conservación por congelación Conservación por liofilización Métodos Alternativos Conservación por transferencia periódica Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar esteril

Métodos Restringidos Desecación en papel de filtro Desecación en suelos,arena silicagel,etc Desecación en bolitas de alginato Desecación en sal gorda para halobacterias

La conservación de cepas microbianas Método de elección o de conservación a largo plazo Conservación por congelación Conservación por liofilización Métodos Alternativos Conservación por transferencia periódica Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar esteril

Conservación de microorganismos por congelación La crioconservación consiste en la conservación de los microorganismos a temperaturas inferiores a cero grados centígrados. Se basa en la paralización del metabolismo celular por la disminución del agua disponible. Objetivos de la crioconservación - Mantenimiento de la viabilidad -crioprotectores -La temperatura de almacenamiento -El estado fisiológico de la célula - Mantenimiento de la estabilidad - Mantenimiento de la pureza

Hielo Hielo Hielo Hielo BACTERIA Hielo Hielo Hielo Hielo H2O H2O H2O

AGENTES CRIOPROTECTORES OBJETIVOS Minimizar daños durante la congelació. Limitar la formación de hielo (tasa de congelación) Vitrificación del agua CARACTERISTICAS No tóxico para la célula. Penetrar facilmente en la menbrana celular. Unirse a los electrolitos o a las moléculas de agua.

Crioprotectores más comunes Glicerol Dimetilfulfóxido (DMSO) Ácido glutámico Glucosa Sacarosa Meso inositol Lactosa Leche Descremada

Conservación de microorganismos por congelación La crioconservación consiste en la conservación de los microorganismos a temper.inferiores a cero grados centígrados. Se basa en la paralización del metabolismo celular por la disminución del agua disponible. Objetivos de la crioconservación - Mantenimiento de la viabilidad -crioprotectores -La temperatura de almacenamiento (-70º,-139º) -El estado fisiológico de la célula (Final f.logarítmica) - Mantenimiento de la estabilidad - Mantenimiento de la pureza

Conservación de microorganismos por congelación La crioconservación consiste en la conservación de los microorganismos a temper.inferiores a cero grados centígrados. Se basa en la paralización del metabolismo celular por la disminución del agua disponible. Objetivos de la crioconservación - Mantenimiento de la viabilidad -crioprotectores -La temperatura de almacenamiento -El estado fisiológico de la célula - Mantenimiento de la estabilidad (fenotípica y genotípica) - Mantenimiento de la pureza (Hacer alícuotas)

Conclusiones Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase logarítmica, a la temperatura óptima, en el medio más adecuado. Ajustar el nº de células a una concentración final de 2-6x106 cél/ml. Añadir los crioprotectores adecuados a una concentración óptima. Repartir la suspensión en ampollas de congelación,cerrarlas hermeticamente y mantenerlas 30 minutos a 30º. Disminuir la tª lo mas rápido posible. A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar rápidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo congelado en un baño a 37-40ºC.

La conservación de cepas microbianas Método de elección o de conservación a largo plazo Conservación por congelación Conservación por liofilización Métodos Alternativos Conservación por transferencia periódica Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar esteril

FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LA CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS POR LIOFILIZACIÓN Es un método de conservación a largo plazo. Se basa en la paralización del metabolismo celular por falta de agua:congelación y sublimación

PROCESO Congelar el agua libre de las células Eliminación del agua Agua congelada Vapor de agua Sublimación 2ª Fase de la Desecación 1ª Fase de la Desecación

PROCESO Congelación Rápida Tª ambiente,4ºC,-196ºC Tubos marcados BOMBA BOMBA condensador Sellado al vacio Ampolla

Tipos de Liofilizadores Liofilizador con centrifugación Se utilizan ampollas de vidrio taponadas La suspensión se centrifuga durante la 1ª fase de la desecación Se estrechan las ampollas y,después de conectarlas a una bomba de vacío,se sellan. Ventajas:Se utiliza la centrifugación para que el proceso de congelación sea suave y de forma homogénea Liofilizador con estantes La suspensión se prepara en viales y,es precongelada a Tª muy bajas antes de aplicar el vacío. La segunda etapa de la desecación se realiza también en el liofilizador. Ventajas:La Desecación es de manera progresiva y continuada

¿Cuándo aplicar la Liofilización? Es un método ampliamente utilizado para conservar distintos Microorganismos. SI NO -Dificultad de un crecimiento Adecuado. -Microorganismos delicados que no resisten el paso de congelación. -A tamaños de células mayores, menos efectivo es el proceso Protozoos,Células animales, Células vegetales,Arqueobac- terias y bacterias delicadas -Bacterias,Levaduras, Hongos,Algunos virus,Algas Ejemplos:Rhodospirillum, ,Azospirillum,vibrio y demás bacterias marinas. -Levaduras miceladas con difi- cultad en la esporulación. -Hongos con grandes conidios o con dificultad en la esporulación.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIÓN Condiciones de Cultivo El medio de cultivo Dependerá del tipo de microorganismo y sus requerimientos nutricionales. Fase de crecimiento del cultivo. F.exponencial. Suspenciones celulares de 108-109 Células/ml en bacterias, algo inferiores en hongos y levaduras. Condiciones de incubación. Tª,aerobiosis, anaerobiosis, etc.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIÓN Preparación de las células para su conservación Composición del medio de la suspensión y adecuada densidad óptica El medio de la suspensión deberá proteger la viabilidad de las células. Usar el crioprotector adecuado en cada caso. Glucosa 7,5% para Anaerobios Glucosa 15% para Levaduras. Glutámico 0,67M para Bacterias Lácticas. Inositol 5% para Bacterias. Leche descremada para Levaduras, Hongos y Actinomicetos. Tipos de ampollas,tubos y viales para la liofilización. Dependerán del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a liofilizar. Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque por su elevada resistencia ofrecerán muchas dificultad en su apertura.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIÓN -Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC. Grado de deshidratación alcanzado. Lo más alto posible. -Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos al vacío para evitar Rehidratación o presencia de gases (como el oxígeno) que pueden dañar las células. -Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante a 18ºC y sin bajar de los 0ºC y, en oscuridad

LIOFILIZACIÓN VENTAJAS -Reducción de la variabilidad del microorganismo. -Largo tiempo de conservación. -Aplicabilidad para la producción y distribución de los lotes DESVENTAJAS -El alto coste inicial del equipo. -La preparación de forma incorrecta de los distintos lotes puede desembocar en un estancamiento de la viabilidad y/o en pérdidas en la estabilidad de los caracteres de los microorganismos

La conservación de cepas microbianas Método de elección o de conservación a largo plazo Conservación por congelación Conservación por liofilización Métodos Alternativos Conservación por transferencia periódica Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar esteril

Conservación por transferencia periódica Es un método en el que los organismos permanecen activos durante el proceso. Consiste en la inoculación de microorganismos en un medio de cultivo adecuado,la incubaión a una Tª adecuada para obtener crecimiento y finalmente el almacenamiento bajo unas condiciones adecuadas. El proceso es repetido a intervalos que garanticen la obtención de un cultivo fresco antes de la pérdida del viejo.

PARA UNA BUENA RESIEMBRA PERIÓDICA Medio de cultivo. Temperatura, tiempo y condiciones de incubación. Intervalo entre dos resiembras Reducción de la temperatura de almacenamiento. Medios no enriquecidos,con limitación de nutrientes. Restricción de la accesibilidad de aire del cultivo.

La conservación de cepas microbianas Método de elección o de conservación a largo plazo Conservación por congelación Conservación por liofilización Métodos Alternativos Conservación por transferencia periódica Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar esteril

Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar esteril Es un método alternativo muy usado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en Suspender en agua esteril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se puede poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del Hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar diluida.

La conservación de cepas microbianas Métodos Restringidos Desecación en papel de filtro Desecación en suelos,arena silicagel,etc Desecación en bolitas de alginato Desecación en sal gorda para halobacterias

Papel de filtro Métodos de desecación Cerrado de Los paquetes Papel semicerrado Papel Watman nº4 15 minutos 121ºC Desecador P R O T E C Gotas de cultivo Papel con cultivo 2-3 semanas 4ºC Cultivo Suspensión celular Cerrado de Los paquetes

Suelo Métodos de desecación G E R M I N A C Ó Almacenamiento a 18ºC 20 minutos 121ºC Tierra esteril 4ºC Microorganismos en fase durmiente P R O T E C 4-5días 25ºC Agotamiento de nutrientes Almacenamiento a 18ºC Cultivo esporulado Suspensión de esporas

Bolas de Alginato Métodos de desecación DESECACIÓN Polimerización del Gotas Placa petri con Papel secante Alginato 3% 13 minutos 121ºC CaCl2 0,03M esteril Medio de Cultivo 0,75M Sacarosa 48horas Gotas de alginato con cultivo DESECACIÓN Gotas de alginato con cultivo 30 minutos Corriente de aire estéril ó bomba de vacío a Temperatura controlada Pérdida del 30% del peso Cultivo Suspensión en agua esteril Polimerización del Alginato