Enzimas de restricción Equipo: 5 Alvarez Herrera Priscila Samantha Carranza Trinidad Rodrigo Guerrero Velázquez Vanessa Huanosta Murillo Luis Enrique

Endonucleasas o enzimas de restricción? Los científicos descubrieron enzimas de restricción (endonucleasas) en bacterias en los años setenta. Comprobaron que estas enzimas cortaban el ADN viral en fragmentos pequeños y no funcionales, con lo que protegían a la bacteria de un virus invasor. De allí el nombre de enzimas de restricción. No todas las endonucleasas son enzimas de restricción

¿Qué son las enzimas de restricción? Enzimas bacterianas que: A) reconocen secuencias específicas de 4 a 8 pares de bases, denominadas sitios de restricción o secuencia de reconocimiento. B) Escinden o rompen ambas hebras de DNA en ese sitio.

Funciones Proteger a la célula de la invasión de DNA extraño. (Principal) Para evitar que su DNA sea también cortado, las bacterias modifican su DNA: generalmente lo metilan. Así en la célula se tienen tres tipos distintos de endonucleasas: Tipo I, Tipo II y Tipo III.

Tipo I y tipo III Reconocen secuencias palindrómicas Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). No cortan justo donde reconocen sino a cierta distancia: Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo.  Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.

Tipo II o enzimas de restricción Reconocen secuencias palindrómicas. Cortan al DNA en el interior de las secuencias de reconocimiento. No metilan Son las enzimas mas utiles para la manipulación especifica de DNA.

Qué tipo de corte hacen las enzimas de restricción? Se obtiene corte en la doble cadena en la región del palíndrome. Extremos cohesivos o pegajosos (clonación molecular) Extremos romos

Extremos cohesivos para clonación

Las enzimas de tipo II son las que se utilizan en biología molecular porque: Cortan directo la secuencia de inserción No modifican la secuencia blanco.

Factores que afectan la reacción de restricción Contaminantes como otras proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS y una alta concentración de sales. Contaminantes cargados negativamente. Superenrollamiento de plásmidos.

Análisis de restricción del DNA Un segmento de DNA puede ser cortado por varias enzimas de restricción. Mapa de restricción Diagrama donde se muestran sitios de corte de enzimas de restricción.

Análisis de restricción del DNA Se utilizan para: Clonación molecular Estudios para clasificación de microorganismos. Obtención de patrones de RFLP. Identificación en evidencias forenses

¿Y la práctica?

Vector recombinante y enzimas disponibles en el laboratorio Dos enzimas de restricción en una mezcla, cortan formando extremos cohesivos BamHI Ndel Vector recombinante presenta sitios de restricción. Solo uno para NdeI y solo uno para BamHI

Ensayo de restricción Enzima de restricción E1 E2 1 uL NdeI + 1 uL BamHI

Continúa.. Incubar a 37°C por 1.5 h. Añadir 0,5 μl de RNasa (1 μg/ml) Incubar 30 min a 37°C. Guardar muestra a -20°C