Estudios de actividad de antifúngicos “in vitro” A.I. Suárez UGC Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

Aumento nº especies hongos patógenos y cambio epidemiología Aumento nº infecciones fúngicas/ Aumento mortalidad en pacientes de alto riesgo (40-90%) Aumento nº especies hongos patógenos y cambio epidemiología p < 0.001 Aumento nº pacientes disfunción sistema inmunitario: SIDA Transplantes Procesos hematológicos/oncológicos/quimioterapia agresiva Pacientes ICU Aumento uso de antifúngicos de uso local y sistémico Aparición de resistencias antifúngicos Necesario disponer de pruebas de sensibilidad a antifúngicos D. Bitar Emerging Infect Dis 2014; 20: 1149-1155

Pruebas de sensibilidad a antifúngicos Objetivo principal: detección mecanismos de resistencia en cepas productoras de la infección. Objetivo secundario: seleccionar el antifúngico activo para esa infección. Factores limitantes al estudio “in vitro”: Características del antifúngico Respuesta inmune paciente Enfermedad de base del paciente Tratamiento de base del paciente Factores asociados al tipo de hongo, incluyendo sensibilidad a antifúngicos Localización de la infección Interacción paciente-hongo infectante-antifúngico

Métodos de detección de la resistencia a antifúngicos Métodos de referencia: Método CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) en Estados Unidos. Método EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility System) en Europa. Microdilución, resultados similares, identifican cepas resistentes entre cepas sensibles, cepas controles . Métodos comerciales: diseñados para el laboratorio clínico Difusión con discos o E-test, Sensititre Yeast One, Micronaut Microdilution, Vitek, ATB fungus 2. Facilidad uso, flexibilidad, estandarizados y rápidos (24 horas). Discrepancias (errores muy mayores) < 5%.

Detección molecular de resistencia antifúngicos Métodos no estandarizados M. Cuenca-Estrella. Clin Microbiol Infect 2014; 20 (Supl 6): 54-59.

Otros métodos detección resistencia a antifúngicos: Citometría de flujo Sin CAS 0.03 mg/L 0.06 mg/L 0.125 mg/l 0.25 mg/L C.glabrata y Caspofungina 4 h incubación Las alteraciones en la viabilidad del hongo se identifican como cambios en la emisión de fluorescencia. Se expresa en MFEC (mínima fluorescencia aumentada), la más baja concentración de antifúngico en el que el % de células con ↑ fluorescencia es > valor CO predeterminado (50% C.glabrata y C.krusei y 40% C.parapsilosis). Vale-Silva L.A. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31:941-946

Otros métodos detección resistencia a antifúngicos: MALDI-TOF MS (Espectrometría de masas) C.albicans wildtype C.albicans mutante fks Discrimina aislados sensibles, de resistentes después de 3 h de incubación con caspofungina Vella A. J Clin Microbiol 2013; 51:2964-2969

Otros métodos detección resistencia a antifúngicos Microcalorimetría isotérmica MHIC (concentración calor mínima inhibitoria): La más baja concentración AF que inhibe 50 % del calor producido por el control sin AF o para CAS y AND, la menor concentración que reduce el pico de flujo de calor en 50%. Furustrand Tafin U. Clin Microbiol. Infection 2012; 18: E241-E245.

¿Qué valor de CMI separa cepas sensibles y resistentes? Puntos de corte, valores cut-off epidemiológicos : Candida spp y Aspergillus spp. Proceso multifactorial: Análisis de la distribución CMIs múltiples laboratorios Cut-off epidemiológicos respecto a la CMI más alta de la población salvaje Parámetros farmacodinámicos/farmacocinéticos Dosis Eficacía clínica R R

Puntos de corte especie-específicos (EUCAST) 2015 + Los puntos de corte epidemiológicos y clínicos poseen una mayor sensibilidad para detectar resistencias emergentes y tienen utilidad clínica.

Puntos de corte especie-específicos (EUCAST) 2015 Los puntos de corte epidemiológicos y clínicos poseen una mayor sensibilidad para detectar resistencias emergentes y tienen utilidad clínica.

Aplicación puntos de corte M.Cuenca-Estrella, J.L. Rodriguez-Tudela Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2010; 8: 267–276.

Incremento % cepas resistentes Impacto nuevos puntos de corte CLSI 2012 Incremento % cepas resistentes Fothergill A.W. y cols. J Clin Microbiol 2014; 52: 994-997.

↑ R azoles: C.tropicalis y C.parapsilosis Candidemias Suiza 2004-2009 ↑ R azoles: C.tropicalis y C.parapsilosis ↑ R Cas: C.glabrata y C.krusei Orash C. y cols. Clin Microbiol Infection 2014; 20:698-705.

Resistencia a antifúngicos Resistencia microbiológica: el patógeno es inhibido por una concentración más alta de ese antifúngico, en comparación con la concentración que inhibe a las cepas sensibles (sin mecanismos de resistencia) Resistencia clínica/fallo tratamiento el patógeno se inhibe a una concentración del antifúngico que conlleva una alta probabilidad de fallo terapeútico (concentración superior a la dosis normal y segura del antifúngico) Resistencia microbiológica y clínica Consecuencias Resistencia M. A. Pfaller and D. J. Diekema J. Clin. Microbiol. 2012; 50:2846-2856.

Epidemiología Gran importancia de la distribución de especies y sensibilidad a antifúngicos en diferentes países y a nivel local en cada hospital. Monitorización continua Estudio Candipop 05/2011-05/2012 Candidemias en España 5 ciudades, 29 hospitales M.Puig-Asensio. Clin Microbiol Infect 2014; 20: O245-O254.

Mecanismos de resistencia en hongos levaduriformes Azoles (Fluconazol, Voriconazol…): 10-25 % Sobreexpresión genes codificantes de bombas de expulsión: * bombas ABC (ATP binding cassette): R cruzada todos azoles * bombas MFS (major facilitator superfamily): R FZ y VOR * ambas. Mutaciones puntuales gen (sustitución aa) codifica la enzima diana ERG11: alteraciones estructura tridimensional proteína, conlleva menor afinidad unión enzima-antifungico: ↑ valor CMI. Sobreexpresión o regulación elevada enzima ERG11 alterado Mutaciones enzima ERG3: Bypass metabólico para sintetizar fecosterol (incapaz reemplazar al ergosterol). R cruzada azoles. Pueden coexistir varios: adquisición secuencial bajo presión antifúngica. Anfotericina B: 1-3 % Mecanismo no claro: mutaciones genes (ERG2, ERG3, ERG5, ERG6,ERG11) que regulan la biosíntesis del ergosterol :cambios composición membrana. Equinocandinas (Caspofungina, Micafungina,…): rara Mutaciones puntuales gen FKS1 que codifica la enzima 1-3 ß glucano sintetasa (síntesis glucanos pared). Mutaciones localizadas en regiones “hotspot” HS1 y HS2. R cruzada: modificación propiedades cinéticas/catalíticas enzima diana. Respuestas adaptativas al stress: ↑ contenido quitina pared y cambios aa que aumentan CMI. Mutaciones FKS intrínsecas de la diana glucanosintetasa, confieren elevadas CMI, en C.guilliermondii y C.parapsilosis. Sin relevancia clínica.

DISMINUCIÓN CONCENTRACIÓN INTRACELULAR ANTIFÚNGICO Sobreexpresión bombas de expulsión: MDR: FZ CDR: azoles Modificación enzima diana Sobreexpresión diana Modificación otras enzimas M. A. Pfaller. Am J Med 2012; 125, S1-S14

M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014; 20 (Supl 6): 42-48.

Candida glabrata Candida parapsilosis M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014; 20 (Supl 6): 42-48.

Candidemias, Madrid, 2007-2013 L.J. Marcos-Zambrano. Antimicrob.Agents Chemother 2014;58:4565-4572.

20-30 % Candidemias : especies FluR intrinseca (Pre-azoles: 85 % C.albicans FluS) M.A. Pfaller. J Clin Microbiol 2012: 50:1199-1203

Resistencia Equinocandinas: Después de ≥ 3-4 semanas de tratamiento Más frecuente en C.glabrata En aumento M. Arendrup. Curr Opin Infect Dis 2014; 27: 484–49.

Mecanismos de resistencia en hongos filamentosos Azoles (Fluconazol, Voriconazol…): < 5% Mutaciones gen Cyp51A: alteraciones estructurales enzima diana 14 -esterol-demetilasa: ↓ afinidad Sobreexpresión bombas expulsión ABC y/o MFS Mutación región promotora Cyp51A : sobreexpresión proteína resultante. Equinocandinas (Caspofungina, Micafungina,…): Mutaciones puntuales gen FKS1 que codifica la enzima 1-3 ß glucano sintetasa (síntesis glucanos pared). Polienos (Anfotericina B): rara. Excepción A.terreus y A.flavus : altas CMI.

Sobreexpresión bombas de expulsión: DISMINUCIÓN CONCENTRACIÓN INTRACELULAR ANTIFÚNGICO Sobreexpresión bombas de expulsión: Aumento nº copias diana Modificación diana INTERACCION ANTIFÚNGICO-DIANA INEFICIENTE

M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014 20 (Supl 6): 42-48.

Resistencia adquirida Aspergillus spp Sin Tratamiento previo: 61% fungicídas agricultura: Europa Occidental, Asía, Pacífico. Prevalencia mutación TR34/L98h cepas aisladas en estos países. 2 genotipos R en aislados R pesticidas Prevalencia aislados ambientales:? Holanda 2007: 10% Dinamarca: suelos 8 % y pacientes: 4% (2009-2011) Pacientes en Tratamiento azoles: Aspergilosis crónica o alérgica con Tto larga duración (3 semanas) Descrito en A.terreus y A.flavus Pacientes en Tratamiento Candinas 1 caso resistencia a Candinas . Infradiagnósticada por problemas técnicos antibiograma (inhibición parcial crecimiento) Pacientes en tratamiento > 3 semanas Prevalencia resistencia a azoles en 19 países (incluido España): 3.2 % (0-25%) Van Der Linden J. ICAAC 2011. Abstr M-490

S.J.Howard. Mycopathologia 2014; 178: 427-433

Situación actual de resistencia a antifúngicos Infraestimada: estudios prevalencia incluyen aislamiento inicial Aislamientos de mucosas o infecciones profundas: % cepas R mayores. Dinamarca: 15% C.albicans FluR y 20% C.dubliniensis FluR muestras mucosas R adquirida menos frecuente que R intrínseca (no plásmidos): en curso Tto. Problemas: C.glabrata: Hemisferio Norte: 30 %. Población anciana. ↑R Fluconazol. 2º Candidemias C.parapsilosis: Hemisferio Sur. Población más joven. 2º Candidemias. ↑ candidemias (uso de Candinas). C.krusei: 5º Candidemia. R intrinseca Flu Aparición nuevas especies crípticas/prevalentes según zona geográfica C.glabrata complex: C.bracarensis y C. nivariensis (0.2 % total). Poco sensible a azoles C.parapsilosis complex: C.parapsilosis sensu estricto, C.metapsilosis, C.orthopsilosis (2 y 4 % en España SR Lockhart . J Clin Microbiol 2008;46:2659-64 Candidemias Resistencia cruzada azoles Cambio epidemiólogico: Uso antifúngicos en Agricultura, Hospital y consumo antifúngicos orales en Atención Primaria: (Onixis, vaginitis;..) Flora comensal intestinal: reservorio infección sistémica

Situación actual de resistencia a antifúngicos Resistencia azoles en A.fumigatus: en aumento 1. Tratamientos prolongados en Aspergilosis crónica: desarrollo de resistencia 2. Cepas de A.fumigatus R azoles en el ambiente/Uso fungicídas en Agricultura. No se puede excluir que el uso de azoles en Agricultura tengan un papel en la R antifúngicos. TR34/L98H Aspergillus spp resistente azoles Diseminación mundial/Problema salud pública: TR34/L98H : India, China, Iran. R cruzada azoles TR46/Y121F/T289A: Europa. VOR, IZV,PZV Mecanismo origen/extensión: desconocido, fungicídas ???? E. Vermeulen. Curr Opin Infect Dis 2013; 26:493–500

Situación actual de resistencia a antifúngicos 3. Aparición cepas de Aspergillus cripticas: no se diferencian morfológicamente pero son intrinsecamente resistentes/más resistentes: A.lentulus, A.tubigensis, A.ustus complex,… A.Alastruey-Izquierdo. Mycopathologia 2014; 178:427-433 S.J. Howard. Mycopathologia 2014; 178:435-439

Resistencia clínica Diagnóstico incorrecto: Tto empírico o anticipado Sindrome de reconstitución inmune inflamatoria Inmunosupresión paciente Tratamiento tardío infección: gran nº organismos Factores virulencia hongo: peor pronóstico Interacciones antifúngico con medicamentos paciente Foco infección Tratamiento incorrecto en duración o cumplimiento Enfermedad base paciente: Prevención infección fúngica pacientes alto riesgo Control enfermedad de base

Consecuencias resistencia a antifúngicos Peor pronóstico y aumento mortalidad Aparición infecciones de brecha durante la profilaxis antifúngica en pacientes con alto riesgo de infecciones fúngicas sistémicas

Indicaciones pruebas sensibilidad Identificación a nivel de género y de forma óptima de especie. Infecciones Candida spp aisladas de líquidos estériles: fluconazol y otros según epidemiología local. Infecciones invasivas fallo tratamiento inicial, infecciones de brecha . Tratamiento prolongado azoles y/o cultivos repetidos con el mismo hongo. Si resistencia cruzada se ampliará estudio a antifúngicos de mayor espectro. Infección invasiva hongos filamentosos raros u otros hongos. Infección sistémica Aspergillus spp en pacientes inmunodeprimidos o Aspergilosis pulmonar crónica o alérgica. Hongos aislados durante profilaxis antifúngica. Infecciones por Aspergillus spp en tratamiento con azoles ( Recomendaciones ESCMID) Estudios epidemiólogicos No es necesario: Hongos con alto nivel de resistencia intrínseca C.krusei y Fluconazol A.terreus y Anfotericina B

Monitorización niveles antifúngicos Hongos filamentosos ↑ coste y tiempo Impacto clínico difícil estimar Itraconazol, Voriconazol, Posaconazol, 5 FC Niveles séricos impredecibles Alteraciones en la absorción, metabolismo, eliminación o interacción con otros medicamentos Niveles adecuados Eficacia Tratamiento Sin Toxicidad Previene emergencia resistencias Ashbee HR. J Antimicrob Chemother 2014; 69: 1162-1176.

Desescalada en el tratamiento empírico Objetivo fundamental en programas de optimización de la política de antibióticos. Equipo multidisciplinar: microbiólogos, infectólogos y farmaceúticos: Epidemiología local Patrones de sensibilidad Bibliografía actual Desescalada basada en estudios de sensibilidad M.R. Ananda-Rajah. Curr Opin Infect Dis 2012; 25:107-115 Se desescaló (estudio sensibilidad) en: Candidemia especies FluS en Tto Equinocandinas: < 40% Pacientes menos graves o C.albicans: 50% Shah DN. J Antimicrob Chemother 2011;66:2146-2151 Paso terapia parenteral a oral: Candidemias ESCMID: 10 días IV → oral ↓ coste Limita desarrollo R al reducir t exposición al antifúngico Bal MA. Int J Clin Pract 2014; 68:20-27

Éxito clínico: Multifactorial R E. Lewis.Current Opinion in Infectious Diseases 2011, 24 (suppl 2):S14–S29

Conclusiones: Las pruebas de sensibilidad a antifúngicos: Detección mecanismos de resistencia en hongo responsable de la infección. Actualmente estandarizadas, en episodios de Candidemia se obtienen en 24 horas tras aislar el patógeno. Comienzan a ser fundamentales en el tratamiento del paciente y en los estudios de vigilancia. Resistencia microbiológica, clínica o ambas. Diferentes mecanismos de resistencia en Género Candida: inducción bombas de expulsión, alteraciones o sobreexpresión en la enzima diana. Indicaciones: infecciones sistémicas Candida spp, hongos aislados durante profilaxis, fallos tratamiento inicial, infecciones invasivas por hongos filamentosos raros,….