Métodos para su Estudio Proteínas: Métodos para su Estudio

Propiedades Espectroscópicas Todos los aminoácidos absorben luz en la región infraroja Sólo Phe, Tyr, & Trp absorben UV Absorbancia a 280 nm es un buen diagnóstico para aminoácidos Espectros en NMR son característicos de cada residuo en una proteína, y medidas de alta resolución en NMR pueden usarse para elucidar la estructura 3D de las proteínas

Espectrofotometría

Separación de Aminoácidos Mikhail Tswett, botánico ruso, separó pigmentos coloreados de plantas por ‘cromatografía’ Existen muchos métodos cromatográficos para separar mezclas de aminoácidos Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía líquida de alta performance (HPLC)

Cromatografía de Intercambio Iónico Perlitas del polímero tienen grupos cargados positiva (int. aniónico) o negativas (int. catiónico) Mezcla de proteínas es añadida a columna con intercambiador (cat) Proteínas se mueven por la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH que se está usando. En el intercambiador catiónico, las proteínas con mayor carga negativa se moverán más rápido y eluirán antes

Intercambiador catiónico: p. ej. Carboximetil – celulosa (CM) Intercambiador aniónico: p. ej. Dietil aminoetil celulosa (DEAE)

Intercambiador catiónico: La resina tendrá carga negativa e intercambiará cationes (p. ej. Na+) por un aminoácido cargado positivamente p.ej. Carboximetil celulosa

Cromatografía de Partición / Tamiz molecular Mezcla de proteínas es añadida a la columna la cual contiene un polímero Moléculas de proteínas se separan en base a tamaño; las más grandes es añadida a la columna la cual cpasan más libremente y aparecen en las primeras fracciones

Cromatografía de Afinidad

Electroforesis Electroforesis en geles de poliacrilamida

Luego de la tinción : con nitrato de plata o Azul de Coomassie

Determinación el peso molecular de una proteína “problema”

Separación de proteínas en dos dimensiones: 1: En base a su punto isoeléctrico

Segundo: En base a su peso molecular

Arbol filogenético basado en secuencia de una proteína/gen conservado

Insulina consiste de dos cadenas polipeptídicas, A y B, mantenidas unidas por dos puentes disulfuro. La cadena A tiene 21 residuos y la cadena B tiene 30 residuos. La secuencia mostrada es la de la insulina bovina.

Determinando la Secuencia Una Estrategia de Ocho Pasos 1. Si hay más de una cadena polipeptídica, separarlas. 2. Romper (reducir) puentes disulfuro 3. Determinar composición de c/ cadena 4. Determinar residuos N- y C-terminal 5. Cortar c/cadena en fragmentos pequeños y determinar su secuencia

Determinar la Secuencia Una Estrategia de Ocho Pasos 6. Repetir paso 5, usando procedimiento de corte diferente para generar un juego diferente de fragmentos 7. Reconstruir la secuencia de la proteína a partir de la secuencia de fragmentos que se sobreponen 8. Determinar las posiciones de los puentes disulfuro

Especificidad de Endopeptidasas Enzima Fuente Especificidad Tripsina Páncreas bovino Rn-1 = +: Arg, Lys; Rn ‡ Pro Quimiotripsina Pancreas bovino Rn-1 = grandes: Phe, Trp, Tyr Rn ‡ Pro Elastasa Páncreas bovino Rn-1 pequeños neutros: Ala, Gly, Ser, Val, Rn ‡ Pro Termolisina B.thermoproteolyticus Rn Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val Rn-1 ‡ Pro Pepsina Mucosa gástrica bovina Rn=Leu, Phe, Trp,Tyr, Rn-1 ‡Pro Endopeptidasa V8 Staphylococcus aureus Rn-1 ‡ Glu

Especificidad de exopeptidasas Enzima Fuente Especificidad Carboxipeptidasa A Páncreas bovino Rn ‡ Arg. Lys, Pro; Rn-1 ‡ Pro Carboxipeptidasa B Páncreas bovino Rn = Arg, Lys; Rn-1 ‡ Pro Carboxipeptidasa C Hojas cítrico Todos los residuos C-terminal libres; pH óptimo = 3.5 Carboxipeptidasa Y Levadura Todos los residuos C-terminal libre, pero lento con Rn = Gly Leucine aminopeptidasa Riñón porcino R1 ‡ Pro Aminopeptidasa M Riñón porcino Todo residuo N-terminal libre

Paso 1: Separación de cadenas Interacción entre subunidades depende de fuerzas débiles Separación es llevada a cabo con : - pH extremo - 8M urea - 6M guanidina HCl - concentración alta de sales (generalmente sulfato de amonio)

Corte de Puentes Disulfuro Paso 2: Corte de Puentes Disulfuro Oxidación de Acido Perfórmico Agentes reductores Sulfhidrílicos - mercaptoetanol - ditiotreitol or ditioeritritol - para prevenir recombinación, seguir con agente alquilante como iodoacetato

Determinar Composición de Aminoácidos Paso 3: Determinar Composición de Aminoácidos Cromatografía de intercambio iónico

Identificar residuos N- y C-terminal Paso 4: Identificar residuos N- y C-terminal Analisis N-terminal : Reactivo de Edman (PTI) Tratamiento con PTI genera derivados de los aminoácidos que son Feniltiohidantoínas Libera al a.a. N-terminal y deja cadena intacta Otros compuestos: Cloruro de dansilo (con aminas primarias, también con e-amino de Lys) Ventaja: producto es fluorescente y puede detectarse en concentraciones muy bajas

Reactivo de Edman

Identificar residuos N- y C-terminal Paso 4: Identificar residuos N- y C-terminal Análisis C-terminal Análisis enzimático (carboxipeptidasa) Carboxipeptidasa A corta cualquier residuo excepto Pro, Arg, y Lys Carboxipeptidasa B (pancreas de cerdo) sólo actúa en Arg y Lys

Fragmentación de las cadenas Pasos 5 y 6: Fragmentación de las cadenas Fragmentación Enzimática tripsina, quimiotripsina, clostripaina, proteasa de staphylococcus Fragmentación Química Bromuro de cianógeno

Fragmentación Enzimática Tripsin - corta en lado C de Lys, Arg Quimiotripsina – lado C de Phe, Tyr, Trp Clostripaina - como tripsina, pero ataca a las Arg más que a las Lys Proteasa de Staphylococcus Lado C de Glu, Asp en buffer fosfato Específico para Glu en buffer acetato o bicarbonato

Corte por Bromuro de Cianógeno

Reconstruyendo la Secuencia Paso 7: Reconstruyendo la Secuencia Usar dos o más agentes fragmentadores en experimentos separados Secuenciar todos los péptidos producidos (generalmente por degradación de Edman) Comparar y alinear péptidos con secuencias que se sobrepongan para determinar la secuencia de la cadena polipeptídica original

Reconstruyendo la Secuencia Comparar corte por tripsina y proteasa de staphylococco en un péptido típico : Corte por Tripsina : A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K Proteasa de Staphylococcus: F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E

Reconstruyendo la Secuencia The correct overlap of fragments: L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K Secuencia Correcta: L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K