Trabajo Práctico Nº 2 Estudio Cinético de la Enzima Sacarasa
Objetivo: Determinar los parámetros cinéticos de la enzima sacarasa
O H H OH H H CH 2 OH O HHOCH 2 O CH 2 OH HO OH H H H Sacarosa Sacarasa + O H H OH H H CH 2 OH H OH Glucosa O CH 2 OH HO OH H H H HOCH 2 H Fructosa Sacarasa Enzima que desdobla a la sacarosa en glucosa y fructosa
+ + + NO 2 O2NO2N OH NO2NO2 Ác. Pícrico CH 2 OH C C C C C HO H OH HO H H H OH Glucosa H2OH2O Agua NO 2 O2NO2N OH NH2NH2 Ác. Picrámico CH 2 OH C C C C C HO O H OH HO H H H OH Ác. Glucónico Valoración Colorimétrica El ácido pícrico (amarillo) se reduce en medio alcalino ante la presencia de glúcidos reductores y se convierte en ácido picrámico (naranja)
Curva de Calibración µmol glucosa Absorbancia Y= 0,0141X µmol Glucosa = Y 0,0141
Materiales Extracto Enzimático Solución de Sacarosa 2 % p/v Hidróxido de Sodio Solución de Ácido Pícrico Provee la enzima sacarasa Provee el sustrato de la enzima Detiene la reacción enzimáticaDetiene la reacción enzimática Alcaliniza el medio, por lo cual los glúcidos reductores pueden actuar sobre el ácido pícricoAlcaliniza el medio, por lo cual los glúcidos reductores pueden actuar sobre el ácido pícrico Al ser reducido se transforma en ácido picrámico (anaranjado), lo que permite determinar la cantidad de glucosa presente en la solución
Sc. Sacarosa 2%p/v NaOH Ácido Pícrico Extracto Enzimático H 2 O destilada Incubar 37 ºC por 10minutos Incubar 37 ºC por 10 minutos
Hervir durante 5’
µmol glucosa.min -1 Conc. Sacarosa Después de 5’
Resultados Concentración de Sacarosa Concentración de Glucosa Absorbancia Velocidad de Reacción Km Velocidad Máxima