2007 Desarrollo Profesional

Transformación de pGLO™ y Purificación de la Proteína GFP (Green Fluorescent Protein) Instructores Essy Levy, M.S. Coordinadora de Programas de Hughes Scholars UCSD, San Diego CA Julie Mathern BioEducation Product Manager Bio-Rad Laboratories, Hercules CA

¿Para que enseñar la transformación genética? Una herramienta poderosa para el aprendizaje Parte de los estándares nacionales curriculares Varias extensiones de practicas de laboratorio Conexiones con el mundo real Conexiones con carreras científicas académicas y en la industria

Dogma Central de la Biología Molecular ADN ARN Proteína Característica

Conexiones con el mundo real GFP es un marcador visual Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas) Localización y regulación de la expresión de un gen Movimiento celular El destino celular durante el desarrollo Formación de los diferentes órganos Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos

Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™ Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad Basado en los estándares curriculares Currículo comprensible para las investigaciones basadas en el proceso del cuestionamiento Compatible con un periodo de clase de 50 minutos Proporciona una clase entera de 32 estudiantes (4 estudiantes por grupo) Costo económico Resultados exitosos en las manos de los estudiantes Seguro para uso en el aula ¡Resultados tangibles! Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

Procedimiento Transformación Day 1 Day 2

Horario para el Taller de GFP Introducción Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína

Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

¿Que es una transformación? GFP Absorción de ADN exógeno; frecuentemente un plásmido circular Lactamasa beta Resistencia a la Ampicilina

¿Que es un plásmido? Un pedazo circular de ADN que se replica autónomamente Evolucionado originalmente en bacterias Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede ser modificado para expresar una proteína de interés

Las diferentes caras de un plásmido Micrografía de transmisión de electrones Gel de agarosa Representación Grafica

Plásmido pGLO Lactamasa Beta -Resistencia a la ampicilina La proteína GFP (Green Fluorescent Protein) Aequorea victoria gen de medusa araC: Regulador Regula la trascripción de GFP

Transformación con pGLO Pared celular GFP Cromosoma Bacteriano (ADN) Lactamasa Beta (resistencia a ampicilina) Plásmidos de pGLO

ADN Bacteriano Célula de Bacteria Plásmido de ADN ADN Geonómico

Regulación de Trascripción Operón de lactosa Operón de Arabinosa Plásmidos de pGLO

Regulación de Trascripción Operón lac Operón ara LacI araC B A D Z Y A Efector (Arabinosa) Efector (Lactosa) araC B A D LacI Z Y A ARN Polimerasa ARN Polimerasa Z Y A araC B A D

Regulación de la expresión del gen Operón ara Operón GFP araC araC Gen de GFP B A D Efector (Arabinosa) Efector (Arabinosa) araC B A D araC Gen de GFP ARN Polimerasa ARN Polimerasa araC B A D araC Gen de GFP

Métodos de Transformación Electroporación Un choque eléctrico resulta en que la célula sea permeable al plásmido ADN Cloruro de Calcio y Choque Térmico Las células químicamente competentes absorben el ADN después del choque térmico

Proceso de Transformacion Suspender las colonias en la Solución de Transformación Añadir el plásmido pGLO ADN Incubar los tubos en hielo ice Choque térmico a 42°C y colocar en hielo Incubar con caldo nutriente LB Extienda la suspensión por la superficie de las placas

¿Porque es importante cada paso de la transformación? Base O O CH2 Azúcar La solución de transformación = CaCI2 La carga positiva del los iones de Ca+2 neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN O Ca++ O P O Base O O CH2 Azúcar OH

¿Porque es importante cada paso de la transformación? Pared Celular GFP 2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular 3. Choque térmico -incrementa la permeabilidad de la membrana celular 4. La recuperación con LB permite la expresión de lactamasa beta Lactamasa Beta (resistencia a ampicilina)

¿Que es el caldo nutriente de LB? Caldo Luria-Bertani (LB) Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés carbohidratos aminoácidos nucleótidos Sales Vitaminas

¿Crecer? ¿Brillar? Siga el protocolo ¿En que placas crecerán colonias? ¿Que colonias brillarán? LB/Amp LB/Amp/Ara LB

Medida de Volumen