Transfección: “Lipofección” Microscopía de fluorescencia Transfección transitoria del cDNA X fusionado a GFP (green fluorescent protein) en células HeLa Cultivo celular Transfección: “Lipofección” Microscopía de fluorescencia Localización subcelular

TRANSFECCIÓN - Introducción de un DNA extraño en células eucariotas OBJETIVO Expresión de proteínas para su purificacón Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular Estudio de promotores y elementos reguladores Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, modificaciones postraduccionales, etc. Interacción de proteínas Clonaje Terapia génica Etc

TIPOS DE TRANSFECCIÓN Transfección transitoria: Análisis rápido (24- 72 horas). Expresión transitoria en el tiempo. No requiere selección Generalmente un porcentaje pequeño de células contiene DNA transfectado

Transfección estable: TIPOS DE TRANSFECCIÓN Transfección estable: Expresión permanente. Genera una nueva línea celular. Requiere selección con antibiótico El 100 % de células contiene el DNA transfectado integrado en su genoma Promoter “cDNA-X” Promoter ANT-RES Antibiótico

Marcadores de selección eucariotas Metotrexato (MTX) Mata a las células que carecen de dihidrofolato reductasa La línea celular huesped debe ser DHFR- El vector contiene el gen DHFR Incrementos en [MTX] aumenta el número de copias génicas G418 (Geneticina) Bloquea la traducción La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor ) Células de mamífero, plantas y levaduras Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Se intercala en el DNA y provoca su rotura - El producto del gen ble se une e impide su unión al DNA - Células de mamífero, levaduras y bacterias

Métodos de Transfección Fosfato de calcio Método simple, barato, baja eficiencia DEAE-dextrano Método simple, barato, alta eficiencia Liposomas catiónicos Método simple, caro, media-alta eficiencia Electroporación, nucleofección Requiere electroporador, alta eficiencia, agresivo Microinyección Muy laborioso, técnicas especializadas, alta eficiencia Biobalística Células vegetales, requiere especialización Retrovirus, Adenovirus Muy eficiente, trabajoso En general, la eficacia de uno u otro depende del tipo celular

Métodos de Transfección

“ Lipofección” Transfección mediada por liposomas y endocitosis Los lipidos catiónicos forman estructuras micelares acomplejados con el DNA Estas estructuras se fusionan con la membrana celular Los complejos se internalizan por endocitosis La pared del endosoma se rompe, liberando el DNA en el citoplasma y potencialmente en el núcleo. El DNA, una vez dentro del núcleo sigue el proceso para la expresión génica Alternativamente, el DNA puede ser degradado dentro del lisosoama

Microscopía de Fluorescencia Detección de proteínas fluorescentes por microscopía de fluorescencia en células Hela transfectadas con los plásmidos pAmCyan1-N1, pZsYellow1-N1 y pHcRed1-N1

Tinción con Mitotracker Incubación Mitotracker CM-H2XRos 45 min in vivo Tinción To-Pro3 1/500 PANEL A CONTROL NEGATIVO PANEL B 1x10-6 M Mitotracker CM-H2XRos Medio de montaje Mowiol

Living Colors® Subcellular Localization Vectors Living Colors Subcellular Localization Vectors codifican proteínas de fusión de diferentes variantes de proteínas flucorescentes y señales de localización o proteínas estructrales subcelulares que localizan la proteína fluorescente en un órganulo o estructura subcelular específica ( actina, tubulina, mitocondria, núcleo, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, membrana plasmática, peroxisomas o endosomas. Permiten visualizar estructras subcelulares directamente por microscopía de fluorescencia en tiempo real y sin fijación, ni uso de tinciones químicas en células transfectadas. Permiten marcaje múltiple (co-localización de un gen de interés) mediante el uso de proteínas fluorescentes con colores diferentes

Uso de Living Colors® Subcellular Localization Vectors para la tinción de orgánulos celulares

Figure 2. Living Colors® AcGFP1 is ideal for multicolor and fluorescence microscopy applications. AcGFP1 and DsRed2 protein fusions were transiently transfected and visualized by fluorescence microscopy. Panel A. pAcGFP1-Mito (mitochondria) and pDsRed2-Nuc (nucleus) in HEK 293 cells. Panel B. pAcGFP1-Golgi (Golgi apparatus) and pDsRed2-Nuc (nucleus) in HEK 293 cells.  

Combinaciones de colores para microscopía